Товары и услуги

Каталог готовых проектов домов. Помощь в подборе, доставка в любую точку мира

Проекты бань из оцилиндрованного бревна и бруса

Товары и услуги

Разработка и согласование проектной документации

Товары и услуги

Фирма «Прокс» успешно работает на рынке комплексного проектирования с 1992 года.

Комплексное проектирование зданий и сооружений, проектирование инженерных сетей

Товары и услуги

Наша компания была создана высококлассными инженерами-проектировщиками. Каждый из нас имел солидный опыт работы до создания «Мастерплана», но, только создав команду, мы получили возможность организовать компанию «Единого окна»

Загородное строительство из газобетона и камня. Коробка дома, под чистовую, под ключ.

Товары и услуги

Компания занимается налоговым консалтингом, бухгалтерией, аудиторскими услугами, а также международным правом.

Сайт является современным развивающимся порталом по предложениям недвижимости в России.

Проектирование и строительство настоящих финских домов под ключ в Санкт-Петербурге и Ленобласти. Нестандартные решения — индивидуальный подход. Полный цикл — от проекта до строительства дома.

Товары и услуги

Геодезия, топография, изыскания, сопровождение строительства

Товары и услуги

Проектирование и Строительство загородных домов и коттеджей под \»ключ\»

строительное проектирование объектов

Сохранить изменения?

TOM1L1 управляет доставкой через мембрану MT1-MMP, чтобы способствовать инвазии клеток рака молочной железы, вызванной ERBB2

Образцы первичной опухоли молочной железы

Набор из 402 образцов ДНК первичной опухоли молочной железы и 84 образца РНК, очищенных из подмножества 402 опухолей, был получен из отделение патологии онкологической больницы Монпелье (ICM) (Франция). Это исследование было одобрено институциональным наблюдательным советом CORT (Comité de Recherche Translationelle) больницы ICM, и от пациентов было получено информированное согласие.Эта серия из 402 опухолей молочной железы включала инвазивные протоковые карциномы (67,7%), инвазивные лобулярные карциномы (19,7%), инвазивные аденокарциномы (7%) и другие гистологические типы (5,5%). Оценка по классификации Скарффа-Блума и Ричардсона была следующей: 10,1% степень 1, 53,8% степень 2 и 36,1% степень 3. Средний возраст пациентов составлял 57,5 ​​лет. Анализ связывания радиолиганда показал, что 69,7% рака были ER + (≥10 фмоль мг ^-1 белка) и 71,9% рецепторов прогестерона были положительными (PR +).

Array-CGH

Данные Array-CGH соответствовали набору данных, описанному в исх. 18. Файлы Gpr загружали в программное обеспечение Nexus 6.0 (Biodiscovery, Эль-Сегундо, Калифорния, США) для выполнения анализа профиля массива CGH. Параметры анализа для сегментации данных и вызова были следующими: значимый порог для алгоритма ранжирования сегментации: 0,005, максимальное расстояние между непрерывными зондами: 6000, минимальное количество зондов на сегмент: 6, усиление: 0,25, потери: -0,25. Nexus 6.0 использовался для расчета и построения индивидуальных профилей, графиков частот, графиков Каплана – Мейера и лог-ранговых тестов.

Количественная ПЦР в реальном времени

Обратную транскрипцию проводили с использованием 1 мкг общей РНК, предварительно обработанной ДНКазой, не содержащей РНКаз (Promega, Франция), SuperScript II RT и 250 нг случайных гексамеров (Invitrogen, Франция). ). Количественные реакции ПЦР проводили на приборе ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Франция) в конечном объеме 15 мкл в соответствии с условиями производителя с использованием SYBR Green в качестве детектора. Праймеры (последовательности см. В дополнительной таблице 5) были разработаны с помощью программного обеспечения Primer Express (Applied Biosystems).Каждый ген количественно оценивали как минимум дважды. Стандартные кривые были определены для каждого гена с использованием серийных разведений одного и того же пула комплементарной ДНК (кДНК) и / или геномной ДНК. Относительные количества были рассчитаны с использованием этих кривых. Относительный уровень экспрессии каждого гена-мишени был нормализован к эндогенному эталону 28S. Затем определяли вариации РНК, вычисляя отношение нормализованного значения каждого гена к нормализованным значениям, полученным из шести нормальных образцов РНК молочной железы.Соотношения, превышающие 1,8 в образцах опухолей, считались сверхэкспрессией, а отношения <0,55 в опухолях - как недостаточная экспрессия. Точно так же относительный геномный уровень каждого гена-мишени был нормализован к медиане эталонных генов ALB / DCK / GAPDH , и вариации числа копий были определены путем вычисления отношения между нормализованным значением каждого образца и средним значением всех опухолей. . Те же пороговые значения, что и раньше, были применены после проверки вариаций ALB , DCK и GAPDH .

Иммуногистохимия

Анализы ИГХ были выполнены с использованием микрочипов ткани (ТМА) толщиной 3 мкм, включая 108 опухолей молочной железы, охватывающих 4 основных подтипа (ER + HER2 +, ER + HER2-, ER-HER2 + и ER-HER2-). Фиксированные формалином и залитые парафином опухоли молочной железы были взяты в трех экземплярах тканевых ядер (диаметром 0,6 мм), взятых из трех различных злокачественных областей, с использованием ручного инструмента для анализа (MTA, Beecher Instrument, США), как описано ⁴⁷ . После извлечения антигена с помощью буфера K8004 (Dako, Дания) срезы ТМА инкубировали с моноклональными антителами против TOM1L1 на платформе Autostainer Link48 (Dako) с использованием системы Flex + для амплификации сигнала и DAB (диаминобензидинтетрагидрохлорид) в качестве хромогена.Слайды закрывали и наблюдали под световым микроскопом. Каждое пятно на срезах ТМА оценивали по интенсивности окрашивания (классифицировалось как 0 (отсутствует), 1 (слабое), 2 (умеренное) или 3 (сильное), см. Рис. 1) и на процент отмеченных клеток (в диапазоне от От 0 до 100%). Затем данные были объединены как среднее из трех значений. Наконец, краткую оценку (QS) в диапазоне от 0 до 300 определяли путем умножения степени интенсивности на процент окрашенных ядер. Этот общий балл для каждой опухоли был дополнительно упрощен путем разделения его на отрицательный (QS <20) или положительный (QS ≥20).

Антитела

Поликлональные антитела против TOM1L1 (1: 2,000) были такими, как описано в ссылке. 23. Моноклональное антитело против TOM1L1 было от Covalab (Лион, Франция). Антитела против ERBB2 (1: 1000), p-CortactinY421 (1: 500), p-AKTS473 (1: 1000), AKT (1: 1000), P44 / P42 MAPK (1: 1000) и p-P44 / P42 MAPK (1: 1000) были получены от Cell Signaling Technology (Данверс, США). Антитела против кортактина (1: 500) были от Millipore (Billeria, США), а антитела против MT1-MMP (1: 100 для if или 1: 500 для иммуноблоттинга) и TOLLIP (1: 200) от Abcam (Кембридж, Великобритания).Антитела против тубулина (1: 2,000), HA-tag (1: 4,000) и p-Tyr 4G10 (1:50) были получены от N. Morin, C. Gauthier-Rouvière и P. Mangeat, соответственно (CRBM, Montpellier, Франция). Анти-кроличий IgG-HRP (1: 5 000) и антимышиный IgG-HRP (1: 5 000) были от GE Healthcare (Fairfield, США). Анти-кроличий и антимышиный IgG, связанные с Alexa-Fluor 488, Alexa-Fluor 594 и Alexa-Fluor 405 (1: 1000), были от Life Technologies (Карлсбад, США). Alexa-Fluor 594-Phalloidin (Life Technologies) использовали для визуализации F-актина.Антитела по технологии GFP-Nanotrap были получены от Chromotek (Planegg-Martinsried, Германия).

Культура клеток и ингибиторы

Все клеточные линии были получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Rockville, MD, USA) и культивированы в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) или среде RPMI 1,640 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки ( FCS), глутамин и антибиотики (гентамицин, пенициллин и стрептомицин) при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ . Стабильные клеточные линии были получены путем отбора с 0.5–1 мкг мл ^–1 пуромицина или 200 мкг мл ^–1 гигромицина B. Реагенты для клеточных культур были от Life Technologies. Для анализа ингибиторов клетки обрабатывали 5 мкМ SU6656 (Merck-Millipore), 1 мкМ лапатинибом (Merck-Millipore), 1 мкМ AG879 (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, США), 12,5 мкМ GM6001 (Merck-Millipore) и 2 мкМ паклитаксела (Sigma-Aldrich) в течение 2–3 часов.

Трансфекции и ретровирусные инфекции

Временные трансфекции выполняли с реагентом jetPEI (Polypus Tranfection, Illkirch, Франция) (кДНК-векторы) и с реагентом Lipofectamine Plus (Invitrogen, Carlsbad, USA) (siRNAs) в соответствии с инструкциями производителя.Клетки трансфицировали за 48 ч до визуализации или лизиса. Процедуры ретровирусной инфекции были такими, как описано в исх. 25.

ДНК-конструкции и мутагенез

конструкции pBABE, кодирующие мышиный TOM1L1, TOM1L1-ΔLinker (делеция аминокислот 292–386), TOM1L1-ΔLinker / L401A, TOM1L1-ΔLinker / TOM1L1-ΔLinker / YFPP424 / YFP4 (R419D / P419D / YFPP4) Были получены -ΔC-ter (делеция аминокислот 388–474), TOM1L1-ΔGAT (делеция аминокислот 157–284), TOM1L1-ΔVHS (делеция аминокислот 1–153), TOM1L1 Ser313A, TOM1L1 Ser320A и TOM1L1 Ser320E. методом ПЦР с использованием системы сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Stratagene, La Jolla, США).Зеленый флуоресцентный белок мыши и человека (GFP) –TOM1L1, GFP – ΔGAT, GFP – Ser320A и GFP – Ser320E были получены путем субклонирования конструкций TOM1L1 в pEGFP. Конструкции, кодирующие HA-TOLLIP (pcDNA3), mCherry-MT1-MMP (pcDNA3) и MT1-MMP pHluorin, Luciferase (pcDNA3.1), были получены от E. Lemichez, P. Chavrier и P. Balaguer, соответственно. GFP-RAB-7, GFP-Rab-5 и GFP-RAB11 (pEGFP) были получены от C. Gauthier-Rouvière.

дуплексов shRNA и siRNA

Мок-РНК или короткая шпилька (shRNA), специфичная для человеческого TOM1L1 , была клонирована в ретровирусном векторе pSiren (имитация: 5′-GACACTCGGTAGTCTATAC-3 ‘; sh- TOM1L1 : -ACAAGAGACTGCTCAAAT-3 ‘или sh- TOM1L1-2 : 5′-CAGAAGGAAGCCAATA-3′). SiRNA, специфичная для человеческого TOLLIP (последовательность: 5′-AAGTTGGCCAAGAATTACGGCdTdT-3 ‘), была разработана с помощью инструмента проектирования Qiagen и получена от Qiagen (Венло, Нидерланды). Контроль и siRNA, специфичные для мыши TOLLIP, мыши и человека MT1-MMP , были получены от GE Healthcare (Dharmacon), Fairfield, США.

Анализы миграции и инвазии

Анализы миграции и инвазии клеток выполняли, как описано в ссылке. 48. Вкратце (20 000 клеток были использованы для анализа миграции) и 50 000–80 000 для анализов инвазии.Клетки фиксировали через 45 мин (миграция) или 24–48 ч (инвазия) и подсчитывали.

Анализ вторжения сфероидов

Анализ вторжения сфероидов проводили, как описано в ссылке. 49. Вкратце, 1000 клеток помещали в среду, содержащую 2,4 мг / мл ^-1 метилцеллюлозы, в лунку 96-луночного планшета с круглым дном и инкубировали в течение 24 часов для получения сфероидов. Затем сфероиды заключали в смесь (2: 1) нейтрализованного бычьего коллагена I (2 мг / мл ^-1 ) и матригеля (3 мг / мл ^-1 ) или в нейтрализованный интактный телопептидный коллаген I из хвоста крысы (1.7 мг / мл ^-1 ) и помещали в лунку 96-луночного планшета с плоским дном, покрытую 50 мкл нейтрализованного бычьего коллагена I или коллагена 1 из хвоста крысы соответственно. За инвазией следили с помощью покадровой микроскопии с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Leica DMIRE2, оснащенного Leica × 10 C PLAN 0,22 LMC в DMEM / 10% FCS под CO ₂ и контролем температуры каждый час в течение 24–48 часов (клетки 3T3) , 72–75 ч (СКБР3) и 75 ч – 5 сут (БТ-474). Инвазивные фронты определялись как от трех до шести слоев клеток, прогрессирующих в матриксе.

Анализ деградации желатина Invadopodia

Анализы деградации Invadopodia выполняли, как описано ^48,50 . Вкратце, покровные стекла инкубировали с 50 мкг мл ^-1 поли-D-лизина, затем с 0,5% глутаровым альдегидом и затем переворачивали на 20 мкл капле желатина + желатин, конъюгированный с Oregon Green 488 (Life technologies) (10: 1) смесь. Затем желатиновую матрицу гасили 5 мг / мл боргидрида натрия ^-1 и регидратировали в полной ростовой среде перед использованием.

Широкопольная и конфокальная визуализация

Широкопольная визуализация использовалась для отслеживания анализов деградации желатина инвадоподий с использованием вертикальных микроскопов Zeiss AxioimagerZ1 или Zeiss AxioimagerZ2 с Zeiss × 10 Plan Apo 0.45, Zeiss × 10 EC Plan Neofluar 0.3, Zeiss × 40 EC Нефть Plan NeofluaR 1.3 DIC или масляные объективы Zeiss × 63 Plan-Apochromat 1.4. Получение изображений и количественная оценка участков поверхности деградации проводились с использованием Metamorph. Для конфокальной визуализации клетки культивировали на покрытых желатином покровных стеклах в течение 3 часов и отображали с помощью конфокального многофотонного микроскопа Leica SP5-SMD или конфокального Zeiss LSM780 и × 63/1.4 Объективы Oil DIC Plan-Apo или Leica × 63 / 1.4 Oil HCX PL APO CS. Изображения были получены с использованием программного обеспечения LAS-AF (Leica, Wetzlar, Германия) или Zeiss Zen 2010 (Zeiss, Оберкохен, Германия). Регулировка яркости, контрастности и медианного фильтра (радиус от 0,5 до 1 пикселя) изображений была реализована с помощью программного обеспечения imageJ. Количественные оценки флуоресценции на рисунках 5b, e и 8g были выполнены с использованием программного обеспечения imageJ и формулы скорректированной флуоресценции клеток (CCF = интегрированная плотность — (площадь выбранной клетки × средняя флуоресценция фоновых показаний) ⁵¹ .Для получения живых конфокальных изображений клетки культивировали на покрытых желатином чашках со стеклянным дном (Ibidi, Plannegg Martinsried, Германия) в течение 2 часов. Клетки получали изображения во влажной атмосфере с 5% CO ₂ при 37 ° C с использованием конфокального микроскопа Leica SP5-SMD с объективами Leica × 63 / 1.4 Oil HCX PL APO CS или Leica × 40 / 1.3 Oil HCX PL APO CS. Быстрое получение было выполнено с помощью высокоскоростного резонансного сканера (8000 Гц) (Leica), чтобы избежать фотообесцвечивания и токсичности. Визуализацию меченного pH-фтором MT1-MMP (дополнительные видеоролики 2 и 3) проводили с использованием самодельной установки TIRF на основе инвертированного микроскопа Zeiss Axiovert 200, оснащенного альфа-анализатором Plan-Fluar × 100/1.45 NA (Zeiss) и с лазером на основе ионов аргона 488 нм (Spectra Physics, Санта-Клара, США). Сигналы флуоресценции собирали через тот же объектив, пропускали через фильтрующий куб, содержащий дихроичное зеркало, пропускающее 510 длин волн (Chroma, Вермонт, США), и отображали на камеру EM-CCD (Andor iXon, Белфаст, Ирландия). Мощность лазера регулировалась акустооптическим перестраиваемым фильтром. Время экспозиции камеры составляло 100 мс. Фильмы были реконструированы с использованием ImageJ.

Анализ с отслеживанием эндосом и лизосом

Клетки, экспрессирующие mCherry-MT1-MMP или меченные 50 нМ LysoTracker-Red (Life Technologies), высевали на покрытые желатином чашки со стеклянным дном и отображали с помощью микроскопа Nikon TE Eclipse с Nikon × 100 PL APO VC 1.4 масляный объектив или конфокальный Leica SP5-SMD с объективами Leica × 63 / 1.4 Oil HCX PL APO CS. Изображения снимались каждые 230 мс в течение 1 мин. Эндосомы mCherry – MT1-MMP или лизосомы, меченные LysoTracker, отслеживали с помощью исследовательских блоков размером 15 × 15 пикселей и 25 × 25 пикселей (функция Metamorph «Отслеживать объект»). Эндосомы 114 (3T3-neu mock), 202 (3T3-neu TOM1L1), 101 (3T3-neuΔGAT), 108 (3T3-neu TOM1L1 ctrl-siRNA) и 112 (3T3-neu TOM1L1 TOLLIP siRNA) были отслежены в a. минимум 10 разных ячеек.Для отслеживания лизосом отслеживалось ≈160 различных лизосом как минимум в 5 различных клетках на одно состояние. Регистрировались скорость (мкм с ^-1 ), расстояние (мкм) и максимальное расстояние от исходной точки (то есть направленность) (мкм). Репрезентации движения эндосом были выполнены с использованием программного обеспечения Chemotaxis and Migration Tool 2.0 (Ibidi).

Стандартный анализ пролиферации

Пролиферацию клеток измеряли in vitro с использованием анализа сульфородамина B для скрининга цитотоксичности (Sigma-Aldrich). Вкратце, 50 000 клеток на лунку высевали в 24-луночные планшеты с 2% средой FCS и затем фиксировали каждый день (в течение 4 дней) в 2 × 6,1 N растворе TCA при 4 ° C в течение 1 часа. Клеточную пролиферацию оценивали по метке белков с помощью 0,4% раствора сульфородамина B и измерению оптической плотности при 490 нм.

Биохимические анализы

Эксперименты по иммунопреципитации и вестерн-блоттинг проводили, как описано в ссылке. 5. Вкратце, клетки дважды промывали PBS и соскребали в 2-кратном буфере для лизиса, содержащем 1% Triton X-100, 10 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 75 ед. Мл ^-1 апротинина и 1 мМ ванадата. Иммунопреципитация проводилась с использованием экстрактов белков 800 мкг – 1 мг и специфических антител; В качестве лизата цельных клеток (WCL) использовали 20–50 мкг белков. Биотинилирование ERBB2 и MT1-MMP клеточной поверхности проводили, как описано в ссылке. 52. Иммунопреципитаты и WCL разделяли на 7,5 / 9/10% гелях SDS-PAGE и переносили на мембраны Immobilon (Millipore Molsheim, Франция). Обнаружение проводили с помощью системы ECL (GE Healthcare).Увеличенные изображения всех иммуноблотов, показанных в основной статье, включены в дополнительный рисунок 10.

Экспериментальный анализ метастазов в мозг и кости

Все процедуры были выполнены в соответствии с Национальным комитетом этического мышления по экспериментам на животных в соответствии с протоколами, утвержденными Комитет по уходу и использованию животных Лангедока-Руссильона (регистрационный номер: CEEA-LR-12072) в аккредитованном учреждении (соглашение № C34-172-27). Внутрисердечная инъекция и детектирование биолюминесценции выполняли, как в ссылке.53. Вкратце, 0,5 × 10 ⁶ клеток neu-NIH-3T3 или 1 × 10 ⁵ клеток HCC-1954 в 50 мкл стерильного PBS Дульбекко без Ca2 + и Mg2 + вводили в левый желудочек сердца в течение 6 недель. старые самки голых или бестимусных мышей BALB / c соответственно (Harlan Laboratories, Le Malourlet, Франция). Мышей анестезировали 2% смесью изофлуран / воздух. Всего в двух независимых экспериментах использовали 12 животных на клеточную линию (3T3-neu mock, 3T3-neu TOM1L1 и 3T3-neu ΔGAT клетки; HCC-1954 mock, HCC-1954 TOM1L1 и HCC-1954 ΔGAT клетки).Для детекции биолюминесценции мышей анестезировали смесью 2% изофлуран / воздух и внутрибрюшинно вводили однократную дозу 150 мг / кг ^-1 D-люциферина (Promega, Мэдисон, США) в PBS. Для подсчета потока фотонов использовалась система камеры устройства с зарядовой связью с системой доставки изофлуорана в форме носового конуса и нагретым столиком для поддержания температуры тела. Визуализация была завершена через 5-10 минут после инъекции люциферина. Результаты анализировали через 1–5 мин воздействия с использованием штангенциркуля ПЗС-камеры Xenogen IVIS Lumina, соединенной с программным обеспечением для сбора и анализа живых изображений (Caliper, Kopkinton, США).Интенсивность сигнала оценивали для всего животного и для дистальных метастазов в голове и ногах, обнаруженных с помощью потока фотонов. Для визуализации ex vivo мышей умерщвляли сразу после инъекции люциферина и in vivo визуализации , а затем препарировали для изображения мозга, ног, сердца (в качестве контроля инъекции клеток), легких и ребер (не показаны).

SILAC и фосфопротеомный анализ

SILAC ( ¹³ C ₆ ¹⁵ N ₄ -Arg и ¹³ C ₆ ¹⁵ N ₂ -Lys в виде тяжелых аминокислот) и триптическое расщепление проводили по существу, как описано ранее в исх.54. Клетки трансфицировали 7 мкг конструкции GFP-hTOM1L1 за 2 дня до лизиса и инкубировали с 1 мкМ лапатинибом за 3 часа до лизиса (первый раз в условиях светлой культуры и второй раз в условиях тяжелой культуры для биологических повторов). GFP-hTOM1L1 очищали с использованием технологии GFP-Nanotrap для обеспечения эффективной специфичности иммунопреципитации и во избежание присутствия тяжелых цепей иммуноглобулина в образцах. Иммунопреципитаты разделяли на гелях SDS-PAGE, и образцы, расщепленные трипсином, полученные из срезов геля GFP-hTOM1L1, анализировали в основном, как описано в ссылке.53. Вкратце, образцы анализировали с использованием наноВЭЖХ (Ultimate 3000, Dionex) / ионизации наноэлектроспреем на масс-спектрометре с орбитальной ловушкой (LTQ-Orbitrap XL, Thermo Fischer Scientific). Обессоливание и предварительное концентрирование образцов проводили в режиме онлайн с использованием колонки Pepmapper (0,3 × 10 мм, Dionex). Градиент, состоящий из 0-40% B в течение 60 минут, 40-80% B в течение 15 минут ( A = 0,1% муравьиной кислоты, 2% ацетонитрила в воде; B = 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитрил) при 300 нл / мин ^-1 использовали для элюирования пептидов из капилляра Pepmap (0.075 × 150 мм) обращенно-фазовая колонка. Спектры записывали с помощью программного обеспечения Xcalibur 2.0.7 (Thermo Fischer Scientific). Спектральные данные анализировали с помощью программы MaxQuant 1.3.0.5. Использовались следующие базы данных: CPS_mouse_2012_10 и человеческий со следующими модификациями: окисление (M), карбамидометилирование (C), модификации SILAC и фосфорилирование (STY).

Статистика

Большинство результатов представлено как среднее ± s.e.m. Анализ отклонений систематически проводился для трех или более условий выборки, и средние значения сравнивались попарно с тестом Стьюдента t с использованием программного обеспечения Prism (GraphPad Software, La Jolla, USA).Для большинства экспериментов порог значимости был зафиксирован на значении P ≤0,05. Для экспериментов по отслеживанию эндосом, поскольку значения не имели нормального распределения (критерий Шапиро – Уилка), для анализа дисперсии использовался критерий Крускалла – Уоллиса, а для сравнений между парами был использован критерий Манна – Уитни. Для кривой Каплана-Мейера, представляющей общую выживаемость инъецированных мышей, статистический анализ был проведен с использованием теста логарифмического ранга (Мантела-Кокса). Для безрецидивного анализа Array-CGH статистический анализ проводился с помощью EpiInfo 6.04 от Центра по контролю и профилактике заболеваний (Атланта, США) для классических χ ² -тестов и с программным пакетом Stata 9.0 (StataCorp LP, College Station, США) для анализа выживаемости. Безрецидивная выживаемость определялась как время от операции до первого местного или отдаленного рецидива. Контралатеральные опухоли также считались рецидивом. Для иммуногистохимического анализа связи между экспрессией TOM1L1 и ER или ERBB2 исследовали с использованием теста Фишера.

Скрамблаза TMEM16F прекращает передачу сигналов рецептора Т-клеток, чтобы ограничить истощение Т-клеток | Журнал экспериментальной медицины

Наша работа представляет новый механизм прекращения передачи сигналов TCR липидной скрамблазой TMEM16F. Мы предполагаем, что вовлечение TCR через повышенные внутриклеточные уровни Ca ²⁺ активирует скрамблазу TMEM16F в поздних эндосомах, чтобы опосредовать образование MVB. Недавно созданные MVB секвестрируют внутриклеточные сигнальные комплексы TCR для последующей лизосомной деградации с целью прекращения активации Т-клеток.Эта опосредованная TMEM16F контрольная точка определяет продолжительность передачи сигналов и надлежащее соотношение T-bet

Мы определили неожиданную локализацию TMEM16F в эндоцитарных компартментах Т-клеток, которая предоставит новое понимание механизмов регуляции эндосомных липидов и ее функциональных последствий для передачи сигналов в клетках. Соответственно, считалось, что регуляция воздействия PS ограничивается плазматической мембраной. Основываясь на наших выводах, эндосомы могут использоваться в качестве дополнительного пула, обеспечивая накопление PS на внешнем листке плазматической мембраны.Действительно, предыдущие исследования показали, что опосредованный кальцием эндосомный транспорт вносит вклад в экспозицию PS при индукции апоптоза (Lee et al., 2013). Однако, поскольку TMEM16F незаменим для воздействия PS во время апоптоза (Segawa et al., 2014), вклад эндосомального пула в TMEM16F-зависимое воздействие PS еще предстоит оценить.

Растущее количество доказательств указывает на то, что эндосомы являются не просто реципиентами интернализованных рецепторов, но также и станциями сортировки либо их деградации в лизосомах, либо рециркуляции в плазматическую мембрану, соответственно (Irannejad et al., 2015). Баланс между деградацией и рециклингом определяет исход сигналов, инициированных на плазматической мембране, в отношении качества вызванных ответов, таких как пролиферация и выживаемость клеток. Более того, эндосомы также служат физической платформой для передачи сигналов (Pálfy et al., 2012). Напр., Рецепторы эндосомального эпидермального фактора роста (EGFR) вносят значительный вклад в общую сигнальную способность EGFR (Fortian and Sorkin, 2014). Более того, эндосомы в Т-клетках содержат несколько ключевых сигнальных молекул TCR (Benzing et al., 2013), активность которых важна для устойчивой передачи сигналов TCR и роста клеток (Yudushkin, Vale, 2010; Willinger et al., 2015). Следовательно, важным вопросом является то, как завершается передача сигналов в эндосомах (Irannejad et al., 2015). Одним из хорошо известных механизмов является сортировка активированных рецепторных комплексов в MVB, в основном опосредованная эндосомным сортировочным комплексом, необходимым для транспорта (ESCRT). Помимо ESCRT, коллективные данные указывают на то, что липиды также играют ключевую роль в генерации MVB.

Наконец, мы демонстрируем, что TMEM16F играет важную роль в ограничении стойкого заражения вирусом. Известно, что постоянная антигенная стимуляция подавляет активацию Т-клеток при хронической вирусной инфекции (Staron et al., 2014). Наша работа показывает, что TMEM16F играет решающую роль в этом процессе, поскольку TMEM16F-дефицитные Т-клетки не способны сдерживать пролиферацию in vivo. Кроме того, было показано, что подавление Т-клеточных ответов во время хронической вирусной инфекции защищает хозяина от иммунопатологии (Ou et al., 2008). Удивительно, но сверхактивация Т-клеток при дефиците TMEM16F не влияет на смертность, а вместо этого приводит к серьезному истощению Т-клеток и дефектным противовирусным ответам, подчеркивая сложный контроль Т-клеточных ответов in vivo. В последнее время были достигнуты значительные успехи в понимании истощения Т-лимфоцитов. Принято считать, что истощенные CD8 Т-клетки по-прежнему сохраняют частичные эффекторные функции, которые имеют решающее значение для сдерживания вирусной инфекции (Paley et al., 2012; Staron et al., 2014). В частности, присутствие предшественников T-bet ^hi в истощенной популяции делает возможной эффективную иммунотерапию благодаря тому факту, что в основном клетки T-bet ^hi обладают потенциалом к ​​восстановлению после блокады пути PD-1 (Blackburn et al. , 2008). Примечательно, что присутствие TMEM16F является предварительным условием для поддержания клеток T-bet ^hi во время хронической инфекции, что делает TMEM16F новым иммунным контрольным пунктом для обеспечения хорошо сбалансированного иммунного ответа (рис.S5). В конечном итоге мы предлагаем нацеливать TMEM16F на усиление его функции, чтобы избежать истощения или активизировать Т-клеточные ответы, что позволяет терапевтическим стратегиям повысить эффективность лечения анти-PD-1 против хронических заболеваний, таких как вирусная инфекция или рак.

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

европейских выпускников | Амстердамский университет, Амстердам, Нидерланды

Фред Виссер

Образование
Амстердамский университет 1985 — 1993
Магистр наук, экономика

UNC Plus Delta 2013 — 2014
Lean Six Sigma, Black Belt

Lagant Management Consultants 2013-2014
PRINCE2, Практик, P2R / NLPB513390

Сертификация IPMA Nederland
IPMA — D, NL.D.2015.0464

EXIN
ITIL, Управление ИТ-услугами, Фонд

Kepner-Tregoe
Управление восстановлением

Sioo, межуниверситетский центр для организации- en veranderkunde 2007 — 2007
Временное управление и организационные изменения

, Университет Эразма
Курсы по организационной стратегии, финансам, маркетингу, ИТ-стратегии и управлению персоналом

NIBE
Основная деятельность финансовых учреждений

Sioo, межуниверситетский центр для организаций- en veranderkunde
Business Consultancy