Кондратьева 154 1: 404. Сторінку не знайдено

Содержание

ул. Герасима Кондратьева (Кирова), 144/3, 154/1 | Сумы

ул. Герасима Кондратьева (Кирова), 144/3, 154/1, Сумы (ул. Герасима Кондратьева (Кирова), 144/3, 154/1): описание ЖК, отзывы, цены, фото, статус строительства. Квартиры в новостройке от строительной компании Федорченко.
Проектом запланирован комплекс эконом-класса, который состоит из 3 10-этажных домов.
Продажу квартир осуществляет застройщик.
Расположение
Новостройка привлекает внимание удобным расположением. С верхних этажей открывается чудесный вид на природу. Жилой комплекс украшают зеленые газоны и места для отдыха.
Также рядом с комплексом раскинулась масса магазинов.
ЖК подойдет семьям, особенно молодым, которым важен покой и домашний уют. ЖК расположен в экологически благоприятном районе.
Описание расположения может быть слегка приукрашеным. Смотрите на карте транспортное сообщение. Переключайтесь на спутник, увидите и деревья, и густоту застройки, и водоемы, если они есть.
Цены
Квартиры в ул. Герасима Кондратьева (Кирова), 144/3, 154/1 продаются по одним из лучших цен Сум для эконом-класса. Застройщик предлагает рассрочку до [уточняется] месяцев, с первым взносом [уточняется] %. Наличие кредита: уточняется.
Характеристики
Новостройку возводят по неизвестно технологии строительства, стены сделаны из неизвестно.
Застройщик продает недвижимость в жилом комплексе ул. Герасима Кондратьева (Кирова), 144/3, 154/1 с неизвестно ремонтом, высотой потолков [уточняется] метра, неизвестно отоплением и алюминиевыми современными радиаторами. Заранее реализовано дополнительное утепление неизвестно и установлены металлопластиковые окна с энергоэффективным стеклопакетом. Необходимые коммуникации подведены заранее.
Планировки
В продаже присутствуют [комнатность уточняется] квартиры с просторой кухней. Площадь жилья [уточняется]. Пространство в квартирах используется рационально. Предусмотрено несколько десятков планировок под любые задачи.
Планировки удовлетворят все запросы. Всего построено 268 квартир.
Дополнительно
Владельцы авто могут на выгодных условиях приобрести место на неизвестно паркинге.
Продажу квартир осуществляет застройщик, в данном случае — Федорченко
Назначить удобное время осмотра объекта можно онлайн или позвонив консультантам и менеджерами компании.

На нашем сайте недвижимости собраны все (или почти все) новостройки Сум.
Наш сайт поможет вам выбрать квартиру от застройщика в новостройке.

Ближайшие ЖК подобраны по расстоянию и стоимости. Показываются ЖК в радиусе до 5 км.

По материалам с интернета.

Отели Stupnikov

249 Отели Stupnikov

Фильтркартаместа

Luxury apart-hotel on Kondrateva street

Герасима Кондратьева 154/1 квартира 160, этаж 9СумыАпартаменты/квартиры

9,7

исключительный

15 отзывы

24 км. СВ от Stupnikov

Апарт-отель Luxury apart-hotel on Kondrateva с балконом расположен в Сумы в регионе Сумы. К услугам гостей бесплатный Wi-Fi и бар. В числе удобств апартаментов 1 спальня, 1 ванная комната и телевизор с плоским экраном. В числе удобств кухня.

Fazenda

Karbysheva str., 43СумыОтели

8,7

невероятный

109 отзывы

25 км. СВ от Stupnikov

Отель «Фазенда» расположен в городе Сумы. К услугам гостей терраса, бесплатный Wi-Fi и бесплатная частная парковка. Номера отеля оснащены телевизором с плоским экраном. В собственной ванной комнате с ванной или душем предоставляются бесплатные туал…

Apart-hotel on Kondrateva street New Building

улица Герасима Кондратьева дом 132/2 этаж 1 квартира 1СумыАпартаменты/квартиры

10

исключительный

5 отзывы

24 км. СВ от Stupnikov

Апарт-отель «На улице Кондраева, новое здание» расположен в городе Сумы. В распоряжении гостей бесплатный Wi-Fi, полностью оборудованная кухня и балкон. Апартаменты располагают 1 спальней, 1 ванной комнатой и телевизором с плоским экраном.

Apart-hotel on Kondrateva street New Building 7 floor

улица Герасима Кондратьева дом 158-1 этаж 7 квартира 47СумыАпартаменты/квартиры

9

превосходный

21 отзывы

24 км. СВ от Stupnikov

Апарт-отель «На улице Кондраева Нового Building 7 этаж» с балконом и бесплатным Wi-Fi расположен в городе Сумы. Апартаменты с 1 спальней, кухней и 1 ванной комнатой оснащены кондиционером. В числе удобств телевизор с плоским экраном.

VIP apartmen

Herasima Kondratieva Street 132/1СумыАпартаменты/квартиры

6,9

Оценка по отзывам

3 отзывы

24 км. СВ от Stupnikov

Комплекс VIP apartmen с баром находится в городе Сумы. К услугам гостей ресторан и бесплатная частная парковка. Апартаменты располагают телевизором с плоским экраном и кабельными каналами, 1 спальней и гостиной. За дополнительную плату предоставляю…

Apartment on Petropavlivs’ka 90

Petropavlivs’ka Street 90, apartment 16, floor 4СумыАпартаменты/квартиры

9,4

превосходный

53 отзывы

26 км. СВ от Stupnikov

Апартаменты «На Петропавловской, 90» расположены в городе Сумы. К услугам гостей бесплатный Wi-Fi, кондиционер и сад с детской игровой площадкой. На территории обустроена частная парковка. В каждых апартаментах есть кухня с микроволновой печью и хо…

Apart-hotel Centr on street Petropavlovskaya 2 room

127 вулиця Петропавлівська этаж 4 квартира 49СумыАпартаменты/квартиры

10

исключительный

1 обзор

25 км. СВ от Stupnikov

Апарт-отель «Центр на улице Петропавловской 2» расположен в городе Сумы. В распоряжении гостей бесплатный Wi-Fi, полностью оборудованная кухня и балкон. Апартаменты располагают кондиционером, 1 отдельной спальней, 1 ванной комнатой с феном и беспла…

Гостиничные номера и сауна

Молодежная улица, 9СумыГостевые дома

9,4

превосходный

46 отзывы

25 км. СВ от Stupnikov

Гостевой дом «Гостиничные номера и сауна» с садом расположен в Сумах. Во всех номерах есть мини-кухня и собственная ванная комната. К услугам гостей бесплатный Wi-Fi и бесплатная частная парковка. Номера оснащены телевизором с плоским экраном и каб…

Квартира 3к Кирова

Суми г.Кондратьєва 122СумыАпартаменты/квартиры

24 км. СВ от Stupnikov

Квартира 3к Кирова is situated in Sumy.

Apartment on Prokopheva st.

Прокофьева 48аСумыАпартаменты/квартиры

9,7

исключительный

3 отзывы

25 км. СВ от Stupnikov

Эти апартаменты расположены в городе Сумы. В апартаментах Prokopheva st. К услугам гостей апартаменты с кондиционером, балконом и бесплатным Wi-Fi. Из окон открывается вид на реку. В апартаментах есть 1 спальня, телевизор с плоским экраном и кабель…

Hôtels, hébergements Nyzhnya Syrovatka — ViaMichelin HOTEL

  • 8.6 (112 avis)

    9.98 km — Karbysheva str., 43, Sumy

  • 9.4 (47 avis)

    10.7 km — Молодежная улица, 9, Sumy

  • 9.6 (15 avis)

    11.1 km — Герасима Кондратьева 154/1 квартира 160, этаж 9, Sumy

  • 10 (5 avis)

    11.

    5 km — улица Герасима Кондратьева дом 132/2 этаж 1 квартира 1, Sumy

  • 7 (3 avis)

    11.5 km — Herasima Kondratieva Street 132/1, Sumy

  • 9 (21 avis)

    11.6 km — улица Герасима Кондратьева дом 158-1 этаж 7 квартира 47, Sumy

  • 10 (4 avis)

    11.6 km — Нижньосироватська вулиця 54 35, Sumy

  • 8.4 (6 avis)

    11.6 km — Prokof’jeva Street 49, Sumy

  • 9 (3 avis)

    11.6 km — вулиця Прокоф’єва 49 кв 51, Sumy

  • 9.6 (3 avis)

    11.7 km — Прокофьева 48а, Sumy

  • 9. 6 (4 avis)

    12 km — 25 Prokof’jeva Street, apt 51, Sumy

  • 9.6 (12 avis)

    12 km — улица Прокофьева дом 25А этаж 4 квартира 25, Sumy

  • 5.6 (9 avis)

    12 km — Kharkivs’ka Street 58В/73, Sumy

  • 9 (10 avis)

    12 km — улица Нижнесыроватская дом 10 этаж 6 квартира 47, Sumy

  • 8.4 (7 avis)

    12 km — 14/3 вулиця Прокоф’єва, Sumy

  • 12 km — вулиця Прокоф’єва этаж 7 квартира 32, Sumy

  • 12.1 km — вулиця Прокоф’єва 24б, Sumy

  • 9 (1 avis)

    12. 1 km — Сумско-Киевских дивизий, Sumy

  • 9.4 (11 avis)

    12.1 km — улица Сумско-Киевских Дивизий дом 22 этаж 8 квартира 89, Sumy

  • 9.4 (17 avis)

    12.1 km — улица Прокофьева дом 16-2 этаж 9 квартира 69, Sumy

  • 9.4 (5 avis)

    12.1 km — 16 вулиця Прокоф’єва, Sumy

  • 9.4 (9 avis)

    12.2 km — Kharkivs’ka Street дом 40/2 квартира 96, Sumy

  • 9.6 (10 avis)

    12.2 km — Kharkivs’ka Street дом 40/2 квартира 52, Sumy

  • 8 (88 avis)

    12.3 km — Zamostianskaya Street 1/4, Sumy

  • 9. 4 (26 avis)

    12.3 km — Prokof’jeva Street дом 14/6 квартира 114, Sumy

  • 9.6 (27 avis)

    12.3 km — Zamostyanskaya Street 1/16, Sumy

  • 9.4 (98 avis)

    12.3 km — 67 вулиця Харківська, Sumy

  • 12.3 km — ул. Прокофьева, дом 14_3, кв. 163, 1 этаж 1, кв. 163, Sumy

  • 9 (6 avis)

    12.4 km — 2-a Kharkivs’ka Street 12, Sumy

  • 9.4 (9 avis)

    12.5 km — улица Петропавловская дом 127 этаж 4 квартира 12, Sumy

  • 10 (1 avis)

    12.5 km — 127 вулиця Петропавлівська этаж 4 квартира 49, Sumy

  • 9 (10 avis)

    12. 5 km — Kharkivs’ka Street дом 34 этаж 1 квартира 47, Sumy

  • 9.2 (12 avis)

    12.6 km — Kharkivs’ka Street 43, Sumy

  • 9.4 (13 avis)

    12.6 km — Harkovskaya Street 43, Sumy

  • 12.6 km — ЖК Заречный, Sumy

  • 9.6 (2 avis)

    12.6 km — жк заречный, Sumy

  • 12.6 km — 26 вулиця Харківська 92, Sumy

  • 10 (1 avis)

    12.6 km — вулиця Харківська 22/1 1этаж, Sumy

  • 10 (2 avis)

    12. 6 km — 41 вулиця Харківська этаж 9 квартира 59, Sumy

  • 9.2 (48 avis)

    12.7 km — Kharkivs’ka Street 22/1 квартира 86, Sumy

  • 10 (1 avis)

    12.7 km — Kharkovskaya Street 22/1, Sumy

  • 9.4 (34 avis)

    12.7 km — Kharkivs’ka Street 6 korp. 1, apartment 31, Sumy

  • 8.6 (4 avis)

    12.7 km — харьковская 31, Sumy

  • 7.4 (8 avis)

    12.7 km — Harkovskaya, Sumy

  • 10 (11 avis)

    12.8 km — вул. Олександра Аніщенка, 1, Sumy

  • 12. 8 km — проспект Михайла Лушпи, Sumy

  • 12.8 km — проспект Михайла Лушпи 2, Sumy

  • 12.8 km — Ulitsa Kharkovskaya, 12, Sumy

  • Hôtels, hébergements Shpylivka — ViaMichelin HOTEL

  • 9.6 (15 avis)

    11.6 km — Герасима Кондратьева 154/1 квартира 160, этаж 9, Sumy

  • 9 (21 avis)

    12 km — улица Герасима Кондратьева дом 158-1 этаж 7 квартира 47, Sumy

  • 7 (3 avis)

    12.1 km — Herasima Kondratieva Street 132/1, Sumy

  • 10 (5 avis)

    12.1 km — улица Герасима Кондратьева дом 132/2 этаж 1 квартира 1, Sumy

  • 9. 4 (9 avis)

    13.1 km — улица Петропавловская дом 127 этаж 4 квартира 12, Sumy

  • 10 (1 avis)

    13.1 km — 127 вулиця Петропавлівська этаж 4 квартира 49, Sumy

  • 8.4 (6 avis)

    13.3 km — Prokof’jeva Street 49, Sumy

  • 9 (3 avis)

    13.3 km — вулиця Прокоф’єва 49 кв 51, Sumy

  • 8.6 (112 avis)

    13.3 km — Karbysheva str., 43, Sumy

  • 9.6 (3 avis)

    13.3 km — Прокофьева 48а, Sumy

  • 9 (1 avis)

    13.4 km — Набережна вулиця р. Стрілки 50 8, Sumy

  • 9.4 (47 avis)

    13.5 km — Молодежная улица, 9, Sumy

  • 8 (4 avis)

    13.7 km — Petropavlovskaya 96, Sumy

  • 9.4 (55 avis)

    13.8 km — Petropavlivs’ka Street 90, apartment 16, floor 4, Sumy

  • 9.6 (117 avis)

    13.8 km — Vulitsya Petropavlovskaya 87, Bldg 3, Sumy

  • 7.4 (29 avis)

    13.9 km — переулок Кнышевский,12, Sumy

  • 6.8 (24 avis)

    13.9 km — Knyshevsky Provulok 12, Sumy

  • 10 (7 avis)

    13. 9 km — улица Петропавловская, 81, Sumy

  • 14 km — вулиця Прокоф’єва 24б, Sumy

  • 9.6 (9 avis)

    14 km — Shishkarevskaya street 12/3, Kvartira 5, Sumy

  • 9 (23 avis)

    14 km — Shishkarevskaya street 12/3, Kvartira 3, Sumy

  • 8.4 (30 avis)

    14 km — 12/3 Shyshkarivs’ka Street, Sumy

  • 9 (13 avis)

    14 km — Shishkarevskaya street 12/3, Kvartira 11, Sumy

  • 9.8 (10 avis)

    14 km — Shishkarevskaya street 12/3, Sumy

  • 9. 6 (8 avis)

    14 km — Shishkarevskaya street 12/3, Kvartira 9, Sumy

  • 9.4 (34 avis)

    14 km — Shishkarevskaya, 12 a, Sumy

  • 9.6 (4 avis)

    14 km — 25 Prokof’jeva Street, apt 51, Sumy

  • 9.6 (12 avis)

    14 km — улица Прокофьева дом 25А этаж 4 квартира 25, Sumy

  • 9 (63 avis)

    14 km — Komsomolskaya Street 100, Sumy

  • 10 (11 avis)

    14.1 km — вул. Олександра Аніщенка, 1, Sumy

  • 8.4 (7 avis)

    14.1 km — 14/3 вулиця Прокоф’єва, Sumy

  • 14. 1 km — вулиця Прокоф’єва этаж 7 квартира 32, Sumy

  • 9.4 (17 avis)

    14.2 km — улица Прокофьева дом 16-2 этаж 9 квартира 69, Sumy

  • 9.4 (5 avis)

    14.2 km — 16 вулиця Прокоф’єва, Sumy

  • 9.8 (14 avis)

    14.2 km — улица Куликовская дом 100 этаж 2 квартира 69, Sumy

  • 14.2 km — 98 вулиця Куликовська этаж 2 квартира 10, Sumy

  • 14.2 km — 98 вулиця Куликовська этаж 1 квартира 4, Sumy

  • 14.2 km — 98 вулиця Куликовська этаж 1 квартира 7, Sumy

  • 14. 2 km — 98 вулиця Куликовська этаж 9 квартира 74, Sumy

  • 14.3 km — Перекопская улица дом 17 кв 18 этаж первый, Sumy

  • 14.3 km — ул. Прокофьева, дом 14_3, кв. 163, 1 этаж 1, кв. 163, Sumy

  • 9.4 (26 avis)

    14.4 km — Prokof’jeva Street дом 14/6 квартира 114, Sumy

  • 14.4 km — улица Первомайская д33, Sumy

  • 14.4 km — ЖК Заречный, Sumy

  • 9.6 (2 avis)

    14.4 km — жк заречный, Sumy

  • 9. 6 (5 avis)

    14.4 km — Herasima Kondratieva Street дом 16 этаж 4 квартира 11, Sumy

  • 9.8 (2 avis)

    14.4 km — вулиця Першотравнева 33, Sumy

  • 9.6 (73 avis)

    14.4 km — вулиця Герасима Кондратьєва, 19 11, Sumy

  • Омский ГАУ | Омский государственный аграрный университет им. П.А. Столыпина

    Асташова Екатерина Анатольевна

    заведующая кафедрой менеджмента и маркетинга

    Булавко Ольга Владимировна

    заведующая инженерным отделением Университетского колледжа агробизнеса

    Вакалова Екатерина Андреевна

    заведующая учебно-методическим кабинетом Университетского колледжа агробизнеса

    Динер Юлия Александровна

    доцент кафедры товароведения, стандартизации и управления качеством

    Дмитриева Нелли Алексеевна

    ученый секретарь Ученого совета университета

    Захарова Татьяна Ивановна

    доцент кафедры гуманитарных, социально-экономических и фундаментальных дисциплин Тарского филиала

    Корчинская Ольга Вирославовна

    старший преподаватель кафедры математических и естественнонаучных дисциплин

    Косарев Григорий Григорьевич

    ведущий инженер управления информационных технологий

    Мозжерина Татьяна Геннадьевна

    начальник службы управления делами ректората и организационным развитием

    Нечаев Сергей Владимирович

    директор спортивно-оздоровительного клуба экспериментального центра по воспитательной работе и социа. ..

    Околелов Владимир Иванович

    профессор кафедры ветеринарной микробиологии, инфекционных и инвазионных болезней

    Паршукова Светлана Сергеевна

    преподаватель отделения среднего профессионального образования Тарского филиала

    Петров Евгений Фёдорович

    доцент кафедры природообустройства, водопользования и охраны водных ресурсов

    Пыхтарева Евгения Григорьевна

    заведующая учебной лабораторией «Агрохимия» кафедры агрохимии и почвоведения

    Ремизова Анна Александровна

    доцент кафедры экономики, бухгалтерского учета и финансового контроля

    Рендов Николай Александрович

    профессор кафедры агрономии, селекции и семеноводства

    Скворцова Елена Алексеевна

    заведующая студенческим общежитием №6 студенческого городка №1

    Степанов Александр Федорович

    профессор кафедры садоводства, лесного хозяйства и защиты растений

    Сухоцкая Светлана Григорьевна

    ветеран агротехнологического факультета

    Теленков Владимир Николаевич

    заведующий кафедрой анатомии, гистологии, физиологии и патологической анатомии

    Тимофеева Наталья Степановна

    заведующая общим отделом научной сельскохозяйственной библиотеки Омского ГАУ

    Федина Галина Николаевна

    специалист по учебно-методической работе I категории деканата землеустроительного факультета

    Четвергова Ирина Георгиевна

    заведующая учебно-научной лабораторией «Ветеринарно-санитарной экспертизы, биологической безопасност. ..

    Щерба Валентина Николаевна

    доцент кафедры землеустройства

    Официальное опубликование правовых актов ∙ Официальный интернет-портал правовой информации

    1.

    Номер опубликования: 2300202103310002
    Дата опубликования: 31.03.2021



    2.

    Номер опубликования: 2300202103310001
    Дата опубликования: 31.03.2021



    3.

    Номер опубликования: 2300202103310003
    Дата опубликования: 31.03.2021



    4.

    Номер опубликования: 2301202103310007
    Дата опубликования: 31.03.2021



    5.

    Номер опубликования: 2301202103310011
    Дата опубликования: 31. 03.2021



    6.

    Номер опубликования: 2301202103310013
    Дата опубликования: 31.03.2021



    7.

    Номер опубликования: 2301202103310012
    Дата опубликования: 31.03.2021



    8.

    Номер опубликования: 2301202103310004
    Дата опубликования: 31.03.2021



    9.

    Номер опубликования: 2301202103310002
    Дата опубликования: 31.03.2021



    10.

    Номер опубликования: 2301202103310003
    Дата опубликования: 31.03.2021



    11.

    Номер опубликования: 2301202103310010
    Дата опубликования: 31.03.2021



    12.

    Номер опубликования: 2301202103310008
    Дата опубликования: 31.03.2021



    13.

    Номер опубликования: 2301202103310006
    Дата опубликования: 31.03.2021



    14.

    Номер опубликования: 2301202103310005
    Дата опубликования: 31.03.2021



    15.

    Номер опубликования: 2301202103310009
    Дата опубликования: 31.03.2021



    16.

    Номер опубликования: 2301202103310001
    Дата опубликования: 31.03.2021



    17.

    Номер опубликования: 2300202103300001
    Дата опубликования: 30.03.2021



    18.

    Номер опубликования: 2301202103300006
    Дата опубликования: 30.03.2021



    19.

    Номер опубликования: 2301202103300004
    Дата опубликования: 30.03.2021



    20.

    Номер опубликования: 2301202103300005
    Дата опубликования: 30.03.2021



    21.

    Номер опубликования: 2301202103300002
    Дата опубликования: 30.03.2021



    22.

    Номер опубликования: 2301202103300003
    Дата опубликования: 30.03.2021



    23.

    Номер опубликования: 2301202103300001
    Дата опубликования: 30.03.2021



    24.

    Номер опубликования: 2301202103300016
    Дата опубликования: 30.03.2021



    25.

    Номер опубликования: 2301202103300019
    Дата опубликования: 30.03.2021



    26.

    Номер опубликования: 2301202103300018
    Дата опубликования: 30.03.2021



    27.

    Номер опубликования: 2301202103300017
    Дата опубликования: 30.03.2021



    28.

    Номер опубликования: 2301202103300014
    Дата опубликования: 30.03.2021



    29.

    Номер опубликования: 2301202103300008
    Дата опубликования: 30.03.2021



    30.

    Номер опубликования: 2301202103300013
    Дата опубликования: 30.03.2021



    Кафедра социальной психологии развития — Преподаватели кафедры — Наталья Сергеевна Денисенкова

    доцент кафедры социальной психологии развития факультета социальной психологии

    ученая степень: кандидат психологических наук (научная специальность 19.00.07 Педагогическая психология)

    ученое звание: доцент по кафедре психология развития

    образование: высшее, отделение психологии и педагогики педагогического факультета МГПИ им. В.И. Ленина (МПГУ, 1986)

    уровень образования: высшее

    наименование направления подготовки и (или) специальности: Психология

    квалификация: Психолог. Преподаватель психологии

    данные о повышении квалификации и (или) профессиональной переподготовке:

    • программа «Теория и практика психологического консультирования», с 11.08.2009 по 30.01.2010
    • программа «Тренинговая форма работы психолога с педагогами, родителями и детьми в ДОУ», 20.03.2009
    • программа «Технологии общения со школьниками» (тренинг-семинар), 09.02.2011

    общий стаж работы: 24

    стаж работы по специальности: 24

    награды, премии, звания: Премия Президента РФ в области образования (1996), Премия Правительства РФ в области образования (2006), юбилейная медаль «В память 850-летия Москвы», Ведомственная награда Министерства образования и науки Российской Федерации – почетное звание «Почетный работник высшего профессионального образования Российской Федерации»

    читаемые дисциплины:

    1. Психодиагностика
    2. Социальная психология развития индивидуальности
    3. Спецпрактикум: социально-психологическая диагностика и консультирование

    сфера научных интересов:

    • развитие способностей дошкольников: диагностика интеллектуальных, творческих, коммуникативных и др. способностей дошкольников, развитие способностей в различных образовательных средах и в семье
    • дошкольное образование (социально-психологический аспект): анализ и построение дошкольных образовательных сред, в том числе образовательных программ, активные методы обучения педагогов и родителей
    • психология одаренного ребенка (социально-психологический аспект): диагностика и развитие ранней одаренности, психологическая помощь одаренным детям и их семьям
    • психологическая диагностика и консультирование, организация психологической службы в детском саду

    основные публикации:

    1. Развитие навыков позитивного взаимодействия со сверстниками у одаренных дошкольников // Социально — психологические проблемы образования: Вопросы теории и практики: сборник научных трудов. Вып. 8 / под ред. М.Ю.Кондратьева. М.: МГППУ, 2010. С.38-49.
    2. Проблемы взаимодействия со сверстниками одаренных детей старшего дошкольного возраста// Актуальные проблемы социально-психологического развития: Вопросы теории и практики: сборник научных трудов. Вып. 1 /Под.ред. Н.Н. Толстых, 2010. С.49-56.
    3. Развитие умственных способностей детей в рамках инклюзивного образования //125 лет Московскому психологическому обществу: Юбилейный сборник РПО: В 4-х томах: Том 2 / Отв. Ред. Богоявленская Д.Б., Зинченко Ю.М.: МАКС Пресс, 2011. – 384 с., С. 184-185.
    4. Образовательно-воспитательная среда как фактор восхождения личности к социальной зрелости (социальное развитие, становление коммуникативных способностей ребенка раннего возраст) // Социальная психология малых групп: Материалы 1 Всероссийской научно-практической конференции, посвященной памяти профессора А.В. Петровского. 25-26 октября 2011г Москва, МГППУ, /Отв. Ред. М.Ю. Кондратьев. –Грант РГНФ №11-06-14054 г М.: МГППУ, 2011. – 600 с., С. 226 -229
    5. Проблемы взаимодействия со сверстниками одаренных детей старшего дошкольного возраста // Актуальные проблемы социальной психологии развития: Вопросы теории и практики: сборник научных трудов. Вып. 1/ Под ред. Н.Н. Толстых. – М.: МГППУ, 2010. – 140 с., С. 49-56.
    6. Влияние семьи на развитие способностей ребенка // Материалы У съезда Общероссийской общественной организации «Российского психологического общества» Москва 14-18 февраля 2012. Т.1. — М.: Российское психологическое общество, 2012. – 496 с., С. 125-126.
    7. Социально-психологические характеристики семьи одаренного ребенка // Інноваційні технології в дошкільній освіті України: розвиток дитячої обдарованості та креативності»: Матеріали Всеукраїнського науково-методичного семінару Інституту розвитку дитини НПУ імені М. П. Драгоманова / Укл. І. І. Загарницька. — Киiв: НЦ «МАНУ», 2012. – 396 с., С. 93-96.
    8. Влияние образовательной среды, как составной части социальной ситуации развития, на становление общих способностей детей // Личность как предмет классической и неклассической психологии: Материалы ХIII Международных чтений памяти Л.С. Выготского: Москва, 13-17 ноября 2012 г. / Под ред. В.Т. Кудрявцева: Ч. 2. – М.: РГГУ, 2012. – 290 с. – С. 13-15.
    9. Сопряженность детско-родительских отношений и развития познавательных способностей дошкольников // Начальная школа плюс До и После. 2013. № 4. – С. 3-7
    10. Социально-психологические аспекты адаптации одаренных детей к школе // Начальная школа плюс До и После. 2013. № 5. — С. 33 – 36. (Соавт. Счастная Т.Н.)
    11. Сопряженность развития воображения и социального статуса дошкольников в группе сверстников // Психологическая наука и образование. 2013. № 1. — С. 85-93. (Соавт. Звягинцева Т.А.)
    12. Социально-психологические аспекты адаптации умственно одаренных детей к школе // Социальная психология в образовательном пространстве. Научные материалы I Международной научно-практической конференции (16-17 октября 2013 г.). – М.: ГБОУ ВПО МГППУ, 2013. – 323 с. — С. 52-53. (Соавт. Волкова С.Д.)
    13. Социально-психологическая мозаика «Портрет дошкольного детства» Рецензия на книгу: Собкин В.С., Скобельцина К.Н., Иванова А.И., Верясова Е.С., Социология дошкольного детства. Труды по социологии образования. Т. XVII. Вып. XXIX — М.: Институт социальной психологии образования РАО, 2013. – 168 с. // Социальная психология и общество. 2014. № 1.- С. 147-154. (Соавт. Кондратьев М.Ю.)
    14. Взаимосвязь стратегии поведения в конфликтной ситуации и социометрического статуса дошкольника в группе сверстников // Психологическая наука и образование psyedu.ru. 2014. № 4. (Соавт. Выроцкова В.В.)
    15. Главы 5 (Детский сад как институт социализации), глава 10 (Социальная психология развития в дошкольном детстве), глава 15 (Использование методик социально-психологического исследования в дошкольном детстве) // Социальная психология развития: учебник для бакалавриата и магистратуры / Под ред. Н.Н. Толстых. Серия: Бакалавр и магистр. Академический курс. М.: Издательство Юрайт, 2014. – 607 с. – С. 140-153; С. 180-303; С. 513-528.

    публикации на PsyJournals

    публикации в РИНЦ

    адрес: Москва, ул. Сретенка, д. 29, каб. 401 (кафедра)

    график работы: согласно расписанию


    Телефон:   +7 (495) 632-95-44

    E-mail:   [email protected]

    Kondratieva M / Moulton-Levy M текущий результат, расписание матчей и результаты — Tennis

    Kondratieva M / Moulton-Levy M текущий результат (и прямая онлайн видео трансляция *), расписание и результаты со всех теннисных турниров, что Kondratieva M / Moulton-Levy М играл. Соперник Кондратьева М / Моултон-Леви М все еще ждем в следующем матче. Он будет показан здесь, как только станет доступно официальное расписание.

    Когда матч начнется, вы сможете следить за Кондратьевой М / Моултон-Леви М в режиме реального времени, обновляемым по пунктам.Статистика обновляется в конце игры. Kondratieva M / Moulton-Levy M предыдущий матч был против Maria T / Woehr J на ​​Acapulco, Mexico, Doubles, матч завершился с результатом 1-2 (Maria T / Woehr J выиграла матч). Kondratieva M / Moulton-Levy M закреплённая вкладка показывает последние 100 Теннисных матчей со статистикой и иконками победа / поражение. Тут так же все Kondratieva M / Moulton-Levy M запланированные матчи, которые будут сыграны в будущем.

    Kondratieva M / Moulton-Levy M график показателей и формы, это уникальный алгоритм SofaScore Прямая трансляция Теннис, что мы генерируем на основе последних 10 матчей команды, статистике, детальном анализе и наших собственных знаниях.Этот график может помочь вам сделать ставки на матчи Кондратьева M / Моултон-Леви M, но имейте в виду, что SofaScore LiveScore не несет ответственности за любые финансовые или другие убытки, прямые или косвенные, в результате каких-либо действий, зависящих от любое содержимое этого веб-сайта.

    В подробностях матча приводится ссылка на его просмотр онлайн Кондратьева М / Моултон-Леви М Прямой эфир, спонсор U-TV. Если этот матч транслируется в прямом эфире U-TV, вы можете смотреть Кондратьеву М / Моултон-Леви М на своем ПК и на мобильном телефоне — iPhone, iPad, Android или Windows phone.Обратите внимание, что права интеллектуальной собственности на трансляцию таких событий обычно принадлежат на уровне страны, и поэтому, в зависимости от вашего местоположения, могут быть определенные события, которые вы не сможете просмотреть из-за таких ограничений.

    SofaScore Теннис текущий результат доступен в виде приложения для iPhone и iPad, приложения для Android в Google Play и приложения для Windows phone. Вы можете найти нас во всех магазинах на разных языках, выполнив поиск по запросу «SofaScore». Установите приложение SofaScore и следите за всеми играми Kondratieva M / Moulton-Levy M в прямом эфире прямо на вашем смартфоне или планшете!

    Diatchenko V / Kondratieva M текущий результат, расписание матчей и результаты — Tennis

    Diatchenko V / Kondratieva M текущий результат (и прямая онлайн видео трансляция *), расписание и результаты со всех теннисных турниров, которые Diatchenko V / Kondratieva M сыграла.Соперник Дятченко В / Кондратьева М еще не известен в следующем матче. Он будет показан здесь, как только станет доступно официальное расписание.

    Когда матч начнется, вы сможете следить за Дьяченко В. / Кондратьевой М. Текущие результаты, обновляемые по пунктам. Статистика обновляется в конце игры. Diatchenko V / Kondratieva M предыдущий матч был против Dushevina V / Makarova E на Wimbledon, London, Great Britain, Doubles, матч завершился с результатом 1-2 (Dushevina V / Makarova E Выйграл матч).Diatchenko V / Kondratieva M закреплённая вкладка показывает последние 100 Теннисные матчи со статистикой и иконками победа / поражение. Тут так же все Diatchenko V / Kondratieva M запланированные матчи, которые будут сыграны в будущем.

    Diatchenko V / Kondratieva M график показателей и формы, это уникальный алгоритм SofaScore Прямая трансляция Теннис, что мы генерируем на основе последних 10 матчей команды, статистике, детальном анализе и наших собственных знаниях. Этот график может помочь вам делать ставки на матчи Diatchenko V / Kondratieva M, но имейте в виду, что SofaScore LiveScore не несет ответственности за любые финансовые или другие убытки, прямые или косвенные, в результате каких-либо действий, зависящих от любого из содержание этого веб-сайта.

    В подробностях матча приводится ссылка на его просмотр онлайн Дьяченко В. / Кондратьева М. Прямая трансляция, спонсор U-TV. Если этот матч транслируется в прямом эфире U-TV, вы можете смотреть Дятченко В. / Кондратьева М. на компьютере и на мобильном телефоне — iPhone, iPad, Android или Windows phone. Обратите внимание, что права интеллектуальной собственности на трансляцию таких событий обычно принадлежат на уровне страны, и поэтому, в зависимости от вашего местоположения, могут быть определенные события, которые вы не сможете просмотреть из-за таких ограничений.

    SofaScore Теннис текущий результат доступен в виде приложения для iPhone и iPad, приложения для Android в Google Play и приложения для Windows phone. Вы можете найти нас во всех магазинах на разных языках, выполнив поиск по запросу «SofaScore». Установите приложение SofaScore и следите за всеми играми Diatchenko V / Kondratieva M в прямом эфире прямо на вашем смартфоне или планшете!

    Роговые зооморфные гребни из Северо-Восточной Европы

  • Архипов Г.А. 1973 Мариицы IX – XI вв. К вопросу о происхождении народа. Йошкар-Ола: мар.Гос. Univ.

    Google Scholar

  • Архипов Г.А. 1984 Дубовский могильник. Археология и этнография Марийского края (Йошкар-Ола). № 8: Новые памятники археологии Волго-Камия: 113–159.

  • Арматинская О.В. 1995 Орнамент резной кости чепецких городищ. В г. Материалы исследования города Идна-Кар IX – XIII вв. .Ижевск: УдИИЫЛ УрО РАН, 1995. — С. 84–97.

    Google Scholar

  • Белецкий С.В. 1980 Культурная стратиграфия Пскова (археологические данные о проблеме происхождения города). KSIA . № 160: Средневековые деревья Восточной Европы: 3–18.

  • Давидан О.Дж. 1962 Гребни Старой Ладоги. Археологический сборник Государственного Эрмитажа , No.4: 95–108.

  • Давидан О.И. 1974 Изделия из рога и кости Старой Ладоги как исторический источник. Кандидат Sc. (История) Диссертация. Ленинград.

  • Дубов И.В. 1989 Великий Волжский путь. Ленинград: Изд. Ленинград. Univ.

    Google Scholar

  • Фехнер М.В. 1963 Внешнеэкономические связи по материалам Ярославских могильников.В г. Ярославское Поволжье X – XIvv . Москва: Наука, с. 70–93.

    Google Scholar

  • Финно-угры и балты в эпоху средневековия . 1987 Москва: Наука.

  • Генинг В.Ф., Гольдина Р.Д. 1970 Позднеломоватовские памятники в Коми-Пермятском округе. Вопросы археологии Урала . Вып. 9: Памятники ломоватовской культуры: 30–56.

  • Гольдина Р.Д., Кананин В.А. 1989 Средневековые памятники верховьева Камы. Свердловск: Урал. Гос. Univ.

    Google Scholar

  • Голубева Л.А. 1966 Коньковые подвески Верхнего Прикамья. Советская археология , № 3: 76–100.

  • Голубева Л.А. 1978 Символы солнца в украшениях финно-угров.В г. Древняя Русь и славяне . Москва: Наука, с. 68–75.

    Google Scholar

  • Голубева Л.А. 1979 Зооморфные украшения финно-угров. Москва, Ленинград: Изд. АН СССР. (Свод археологических источников; Вып. E1–59).

    Google Scholar

  • Иванов А.Г. 1998 Этнокультурные и экономические связи населения бассейна р.Чепцы в эпоху средневековия. Ижевск: УдИИЫЛ УРО РАН.

    Google Scholar

  • Иванова М.Г. 1974 Хозяйство северных удмуртов во второй половине IX — начало XIII т. Канд. Sc. (История) Диссертация. Г. Москва.

  • Иванова М.Г. 1982 Городище Гурия-Кар. В г. Средневековые памятники бассейнов. Чепцы . Ижевск: НИИ при Совете министров УдАССР, с.3–26.

    Google Scholar

  • Иванова М.Г. 1998 Иднакар: Древнеудмуртское городище IX – XIII вв. Ижевск: УдИИЫЛ УРО РАН.

    Google Scholar

  • Иванова М.Г., Куликов К.И. 2001 Древнеудмуртская мифология и Ригведа. В г. Археология и этнография Марийского края . № 25: Древности Поволжья и Прикамия.Йошкар-Ола: С. 136–149.

  • Кирпичников А.Н., Сарабиянов В.Д. 2003 Старая Ладога: Древняя столица Руси. Санкт-Петербург: Славия.

    Google Scholar

  • Кондратьева О.А. 1981 Зооморфные гребни IX – X вв. KSIA . № 166: Средневековые деревья: 103–109.

  • Кондратьева О.А.1999 «Язык» гребня: К вопросу о семиотическом статусе вещи. В Раннесредневековые древности Северной Руси и ее соседеи . Санкт-Петербург: ИИМК РАН. С. 80–88.

    Google Scholar

  • Косарев М.Ф. 2003 Основы языческого миропонимания. Г. Москва.

  • Крыласова Н.Б. 2001 История прикамского костюма. Пермь: Пермь. Гос. Пед.Univ.

    Google Scholar

  • Куликов К.И., Иванова М.Г. 2001 Семантика символов и образов древнеудмуртского искусства. Ижевск: УдИИЫЛ УРО РАН.

    Google Scholar

  • Лазарева С.В. 2003 Истоки производства предметов из кости, кожи и дерева у финно-угров Поволжья. В Древности .Москва, Казань: н.п., с. 177–181.

    Google Scholar

  • Lenz G.T. 2004 Гребни городища Анюшкар. В Путями средневековых торговцев . Пермь: Пермь. Гос. Пед. Ун-та, с. 58–77.

    Google Scholar

  • Мифы народов мира . 1980 Т. 1. Москва: Советская энциклопедия.

  • Наговицын Л.А., Иванова М.Г. 1995 Первобытнообщинный строй на территории Удмуртии. В г. Материалы по истории Удмуртии . Ижевск: УдИИЫЛ УрО РАН, 2004. С. 4–48.

    Google Scholar

  • Первухин Н.Г. 1896 Опыт археологических исследований Глазовского уезда Вятской губернии. Г. Москва. (Материалы по археологии восточных губерний России; т.2).

  • Петренко В.П. 1984 Финно-угорские элементы в культуре средневековой ладоги. В г. Новое в археологии СССР и Финляндии . Ленинград: Наука, с. 83–90.

    Google Scholar

  • Седых В.Н., Макарова В.В. 2001 Этнокультумые импульсы в Ярославском Поволжье в конце и тыс. н.э. по материалам из кости (предварительное сообщение).В г. Миграции и оседлость от Дуная до Ладоги в первом тысячелетии христианской эры . Санкт-Петербург: Староладожский ист.-архитектор. я археол. музей-заповедник, с. 95–99.

    Google Scholar

  • Семенов В.А. 1980 Варнинский могильник. В Новый Памятник Поломской Культуры . Ижевск: НИИ при Совете министров УдаССР, 5–135.

    Google Scholar

  • Семенов В.А. 1988 Толионский могильник IX — начала Xv. В г. Новые исследования по древней истории Удмуртии . Ижевск: УдИИЫЛ УрО АН СССР, 25–58.

    Google Scholar

  • Спицин А.А. 1895 Приложения. В г. Бранденбург Н.Э. Курганы южного Приладожия . Н.П .: С. 150–170. (Материалы по истории России; № 18).

  • Старая Ладога — древняя столица Руси: Каталог выставок . 2003 Санкт-Петербург: Гос. Эрмитаж.

  • Судаков В.В., Буланкин В.М. 2005 К вопрос о начальном этапе славянского расселения в Среднем Поче. В г. Русь в IX – XIV веках: Взаимодействие Севера и Юга . Москва: Наука, с. 269–280.

    Google Scholar

  • Тваури А. 2001 Muinasaj readus. К. 10: Муйнас-Тарту. Тарту, Таллинн: Tartu Ulikool.

    Google Scholar

  • Успенская А.В. 1967 Нагрудные и поискные привески. Труды Гос. Исторического музея . Вып. 43: Очки по истории русской деревни: 88–132.

  • Границы | Сверхэкспрессия аденилатциклазы, кодируемой геном Mycobacterium tuberculosis Rv2212, обеспечивает улучшение приспособленности, ускоренное восстановление после покоя и повышенную вирулентность у мышей

    Введение

    Бессимптомные формы туберкулеза (ТБ), когда инфицированные люди переносят возбудитель в спящем состоянии без заметных симптомов болезни в течение очень долгого времени, называются латентной туберкулезной инфекцией (ЛТБИ).У некоторых из этих латентно инфицированных людей инфекция со временем переходит в активное состояние, становится заразной и серьезно влияет на эпидемиологическую ситуацию (Barry et al., 2009). Условия, при которых неактивная микобактерия Mycobacterium tuberculosis ( Mtb ) переходит в активное размножение (реанимация), а также механизмы перехода плохо изучены. Таким образом, в настоящее время проблема развития и реактивации ЛТИ является одной из самых актуальных в инфекционной медицине.

    В исследованиях, направленных на понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе покоя и реанимации Mtb, значительный объем информации был получен с использованием экспериментальных моделей in vitro , которые имитируют развитие покоя микобактерий и реанимацию (Shleeva et al., 2002, 2011). Например, роль аденилатциклазы (AC), кодируемой геном MSMEG_4279 , была выяснена с помощью модели реанимации покоящейся Mycobacterium smegmatis .Было показано, что штамм M. smegmatis , несущий нокаут-мутацию в гене MSMEG_4279 , был неспособен к реанимации и требовал добавления экзогенного цАМФ для реактивации. Более того, трансформация M. smegmatis и M. tuberculosis с плазмидой, содержащей ген MSMEG_4279 , экспрессируемый под Tet-промотором, что приводило к его гиперэкспрессии и увеличению внутриклеточной концентрации цАМФ, предотвращало переход два вида бактерий переходят в состояние покоя в стрессовых условиях (Шлеева и др., 2013). Это говорит о том, что в присутствии большого количества цАМФ, обеспечиваемого AC, бактерии сохраняли свое активное состояние. Однако прямых доказательств «противодействующей» роли гена (ов) M. tuberculosis , кодирующего AC для Mtb , по-прежнему не хватало.

    Гомолог MSMEG_4279 в Mtb — это ген Rv2212 , который является основным продуцентом цАМФ среди 16 биохимически активных AC-кодирующих генов, присутствующих в геноме (Abdel Motaal et al., 2006; Knapp and McDonough, 2014). Мы предположили, что в стрессовых условиях ген Rv2212 , как и MSMEG_4279 , способствует сохранению активного метаболического состояния Mtb , а также реактивации покоящихся бактерий из-за увеличения продукции цАМФ. Чтобы проверить эту гипотезу, мы создали новый штамм Mtb , несущий плазмиду, содержащую Rv2212 , экспрессируемую под Tet-промотором, и сравнили фенотипы in vitro и in vivo этого штамма с избыточной экспрессией Rv2212 с контролем. штамм, несущий «пустую» плазмиду.Наши данные ясно демонстрируют, что активность АС, зависящая от Rv2212 , которая приводит к повышенной продукции цАМФ, поддерживает жизнеспособность Mtb в неблагоприятных условиях в культуральной среде и внутри хозяина, а также его реанимацию из состояния покоя.

    Материалы и методы

    Бактериальные штаммы, среды для выращивания и условия культивирования

    Использовали штамм h47Rv Mtb дикого типа и его производные, несущие плазмиды pMind Rv2212 (см. Ниже) и pMind (контроль пустой плазмиды).Гигромицин B добавляли к питательной среде в концентрации 50 мкг / мл для штаммов, содержащих плазмиду. Все штаммы обычно поддерживались на стандартной среде Саутона: 0,5 г KH 2 PO 4 , 1,4 г MgSO 4 · 7H 2 O, 4 г L-аспарагина, 60 мл глицерина; 0,05 г цитрата железа и аммония; 2 г цитрата натрия, 0,1 мл 1% ZnSO 4 · 7H 2 O, доведено до 1 л с помощью H 2 O при pH = 7,0 (доведено 1 M NaOH) и дополнено ADC (белок, глюкоза и NaCl) с 0.05% Твин-80 (Коннелл, 1994).

    Популяции микобактерий, состоящие из бацилл, утративших способность расти на твердой среде («некультивируемость», NC) из-за постепенного подкисления среды во время стационарной фазы роста, были созданы, как описано ранее (Шлеева и др., 2011). Вкратце, бактерии хранили в течение 12-15 дней в 50 мл среды Саутона с добавлением 0,05% Tween-80 и ADC в конических колбах объемом 150 мл на орбитальном шейкере (200 об / мин). Эти бактериальные культуры служили для инокуляции аликвот модифицированной среды Саутона для установления NC бактерий.Модифицированная среда Саутона, в которой Твин-80 заменен на 0,025% тилоксапола и ADC — на 0,5% бычий альбумин, аналог Кон (Sigma) по сравнению со стандартной средой Саутона, в дальнейшем называется средой «глицерин». Другой состав модифицированной среды Саутона, содержащей 4% глюкозы и 0,2% глицерина, в дальнейшем называется средой «глюкоза». Начальные значения pH в обеих модифицированных средах составляли 6,2, в отличие от pH = 7,0 в стандартной среде Саутона. Посевной материал исходной культуры объемом 1 мл добавляли к 200 мл модифицированной среды Саутона, помещенной в конические колбы на 500 мл (3–5 колб на эксперимент), и инкубировали при встряхивании при 37 ° С в течение 40–60 дней.Значение pH среды измеряли периодически, и при достижении 6,0–6,2 культуры переносили в закрытые пластиковые пробирки объемом 50 мл и добавляли 2- (N-морфолино) этансульфоновую кислоту (MES) до конечной концентрации 20 мМ. для предотвращения дальнейшего подкисления при длительном хранении. Инкубацию продолжали в статических условиях (т.е. без перемешивания) при комнатной температуре в течение до 200 дней после инокуляции в темноте. Периодически образцы собирали из разных пробирок для оценки количества КОЕ и результатов, полученных с помощью анализа наиболее вероятных чисел (MPN) (подробности см. Ниже), чтобы контролировать появление бактерий NC.В некоторых экспериментах к среде добавляли гидрохлорид тетрациклина до конечной концентрации 20 нг на мл.

    Реанимацию NC бактерий проводили в среде для реактивации — смеси 1: 1 стандартной среды Саутона и среды Nutrient Broth E (NBE) (HiMedia, Индия) с добавлением 0,025% тилоксапола (Sigma) в двух форматах. Для формата MPN использовали пластиковые пробирки объемом 15 мл (Corning, США), содержащие 2 мл реактивационной среды. Последовательно разведенные бактерии NC инкубировали в трех экземплярах при 37 ° C в течение 30–50 дней без встряхивания и подсчитывали количество пробирок с видимым ростом бактерий.Значения MPN определялись с использованием стандартных статистических таблиц (de Man, 1975). Для периодического формата покоящиеся бактерии Mtb , полученные, как описано выше, промывали 10 раз PBS, ресуспендировали в 200 мл реактивационной среды при исходном OD 600 = 0,2–0,3, помещали в колбу на 500 мл и инкубировали при 37 ° C в течение 45 дней при перемешивании со скоростью 100–120 об / мин. Значения OD периодически были в культурных образцах.

    Оценка бактериальной способности образовывать КОЕ

    Бактериальные суспензии последовательно разводили в свежей среде Саутона, и трижды 100 мкл образцов из каждого разведения наносили по каплям на агар Саутона.Планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 21 дня и подсчитывали количество колониеобразующих единиц (КОЕ). Предел обнаружения составил 10 КОЕ / мл.

    Манипуляции с ДНК

    Плазмида сверхэкспрессии pMind Rv2212 была сконструирована следующим образом:

    Амплификацию геномной ДНК M. tuberculosis проводили с использованием праймеров:

    Up2212 5’CT GGATCC TCGCTCACGGCGTCCCACCCTA3 ‘,

    Low2212 5’CA ACTAGTT CGCGACGGCGACGGAGGGGGATAG3 ‘.

    Сайты ограничения подчеркнуты. Продукты амплификации сначала клонировали в вектор pGEM-T (Promega), а затем субклонировали в вектор pMind с использованием рестрикционных ферментов BamHI и SpeI (Thermo Scientific). Escherichia coli и M. tuberculosis трансформировали вектором pMind Rv2212 с помощью электропорации. После выращивания на селективной среде колонии проверяли с помощью ПЦР, плазмиды из колоний экстрагировали и проверяли секвенированием.

    Ex vivo Анализ КОЕ

    колоний микобактерий ( N = 50), полученных из гомогенатов легких, анализировали с помощью ПЦР для подтверждения наличия вставки гена Rv2212 . Амплификацию проводили с использованием праймеров, специфичных для p-Mind:

    Up-pMind 5’CCGGGCCCCGAGCAACACG3 ‘

    Низкий pMind 5’CCGCAGGCTCGCGTAGGAATCATC3 ‘

    Все полученные продукты имели длину около 1300 п.н., что соответствует размеру вставки гена.

    Определение цАМФ

    Образцы Mtb из разных штаммов и временных точек хранения центрифугировали при 13000 g в течение 5 мин. Гранулы обрабатывали 1 мл нагретой до 95 ° C 0,1 н. HCl в течение 10 мин и немедленно замораживали. Образцы разрушали в гранулированном гомогенизаторе FastPrep-24 (MP Biomedicals, Нидерланды), бактериальные остатки удаляли центрифугированием, и уровни цАМФ измеряли в лизатах с помощью ELISA с использованием кроличьих анти-цАМФ-антител (1: 5000) и цАМФ-пероксидазы. конъюгат (HRP, 1: 20 000) (GenScript, США).Результаты регистрировали в трех экземплярах при 450 нм с использованием ридера для микропланшетов Zenyth 3100 (Anthos Labtec Instruments, Австрия). Было выполнено не менее трех независимых измерений.

    Мыши и инфекция

    Мышей инбредных линий I / StSnEgYCit (I / St) и C57BL / 6JCit (B6) выращивали и содержали в обычных, без SPF условиях в Животноводческих помещениях Центрального института туберкулеза (ЦИТ, Москва, Россия) в соответствии с с инструкциями Минздрава России № 755 и в соответствии с Гарантией № A5502-11 Управления по благополучию лабораторных животных Национального института здравоохранения (OLAW).Вода и еда были предоставлены ad libitum . Использовали самок мышей 8–12-недельного возраста в начале экспериментов. Все экспериментальные процедуры были одобрены комитетом по уходу за животными CIT.

    Мышей инфицировали внутривенно 5 × 10 6 бактерий на мышь в 0,5 мл стерильного PBS. В этих экспериментах не вводили ни тетрациклин, ни гигромицин B. Для оценки микобактериальной нагрузки в селезенке и легких 0,2 мл серийных 10-кратных разведений индивидуальных гомогенатов всего органа, полученных от 4 мышей на группу, высевали на агар Дубоша, и подсчитывали колонии через 21–23 дня инкубации при 37 ° C. .Были проведены два независимых эксперимента и их результаты объединены. Смертность проверяли еженедельно.

    Статистика

    OD, КОЕ, концентрации цАМФ, индекс реанимации (RI) выражали как среднее значение ± SEM. MPN были рассчитаны с использованием доверительных интервалов (95%). Достоверность различий для экспериментов in vivo и оценивали с помощью ANOVA, значение P <0,05 считалось значимым.

    Результаты

    Рост

    штаммов Mtb и реанимация спящих бактерий In vitro

    Для изучения влияния AC на рост и реанимацию Mtb мы сконструировали штамм (pMind Rv2212 ), сверхэкспрессирующий AC под контролем промотора тетрациклина (Tet), и продемонстрировали, что этот штамм демонстрирует статистически значимое увеличение внутриклеточного Уровни цАМФ в экспоненциальной фазе по сравнению с контрольным штаммом pMind с пустым вектором.Неиндуцированный штамм также демонстрировал повышенный уровень экспрессии цАМФ, сравнимый с таковым у индуцированного штамма (рисунок S1). По-видимому, в отсутствие индуктора уровень фоновой экспрессии под промотором Tet в Mtb является достаточным, что полностью согласуется с нашими находками в M. smegmatis для сверхэкспрессированного MSMEG_4279 (гомолог Rv2212 ). (Шлеева и др., 2013). После этого мы сравнили рост этих штаммов в жидкой среде Саутона.Как показано на рисунке 1, бактерии, сверхэкспрессирующие AC, росли быстрее, чем контрольный штамм. Примечательно, что сильное различие в скорости роста между двумя штаммами было легко выявлено, если исходный инокулят содержал небольшое количество бактерий (10 2 на мл), то есть обеспечивал более неблагоприятные условия для инициации роста, чем большие исходные популяции (Мукамолова et al., 2002). Действительно, когда посевной материал большего размера на 3 log инициировал рост двух штаммов, скорость размножения оказалась почти одинаковой (рис. S2).Мы также заметили, что, в отличие от бактерий pMind, pMind Rv2212 быстро восстанавливается из старого инокулята и из высушенных образцов (данные не показаны).

    Рисунок 1 . Выращивание штаммов M. tuberculosis на стандартной среде Саутона. Рекомбинантный штамм M. tuberculosis , содержащий вектор pMind Rv2212 (темные кружки) или пустой вектор pMind (белые кружки), культивировали в стандартной среде Саутона при перемешивании (200 об / мин) при 37 ° C.Исходный размер инокулята составлял 10 2 клеток на мл. Этот эксперимент был повторен трижды с аналогичными результатами. Показан один репрезентативный эксперимент.

    Затем мы изучили, влияет ли сверхэкспрессия гена Rv2212 на переход активно растущих бактерий в состояние покоя. Мы исследовали ранее разработанную модель, которая позволяет накапливать спящие овоидные клетки при постепенном самоокислении ростовой среды во время длительной стационарной фазы.Эти покоящиеся бактерии, которые демонстрируют отчетливую морфологию и характеризуются «некультивируемостью» (NC), то есть временной потерей способности расти на твердой среде, могут развиваться в модифицированной среде Саутона, содержащей либо глицерин (Shleeva et al. ., 2011) или глюкозу в качестве основного источника углерода. Как показано на фиг. 2A, в среде на основе глицерина развитие бактерий NC pMind Rv2212 было значительно отложено по сравнению с бактериями NC pMind. После развития в среде на основе глюкозы бактерии pMind Rv2212 обеспечивали идентичное количество КОЕ на твердой среде в течение всего периода наблюдения, тогда как контрольный штамм постепенно приобретал фенотип NC, хотя и намного медленнее, чем в среде на основе глицерина (рис. 2Б).Разница между двумя средами может быть связана с более быстрым подкислением среды на основе глицерина во время роста штамма pMind и отсутствием подкисления среды на основе глюкозы во время роста штамма pMindRv2212 (данные не показаны).

    Рисунок 2 . Избыточная экспрессия Rv2212 влияет на переход M. tuberculosis в неактивное «некультивируемое» состояние. Рекомбинантные штаммы Mtb , содержащие вектор pMind Rv2212 (темные кружки) или пустой вектор pMind (белые кружки), выращивали в «глицерине» (A) или «глюкозе» (B) , модифицированной средой Саутона при перемешивании (200 об / мин) при 37 ° C.Подробнее см. Материалы и методы. Минимальный порог определения КОЕ составлял 10 клеток на мл. SEM для определения КОЕ было <20%. Эксперименты, показанные в (A) и (B) , были повторены два раза и четыре раза соответственно. Показаны типичные результаты.

    По крайней мере, некоторые бактерии NC способны к реанимации после культивирования в подходящей жидкой среде. Во время хранения культуры количество бактерий, временно существующих в состоянии NC, но сохраняющих способность к реанимации, оценивалось с помощью анализа наиболее вероятного числа (MPN) на основе серийных разведений бактерий, инкубированных в жидкой среде (de Man, 1975; Shleeva et al. ., 2002). Построив график результатов анализа MPN против количества КОЕ (так называемый индекс реанимации, RI), мы оценили развитие состояния NC в двух штаммах бактерий, а также вклад этих покоящихся бактерий, которые сохранили свою способность к реанимации. при длительном хранении до общей численности бактериальной популяции. Как показано на фиг. 3A, RI варьировала от 10 0 (1, соответствует полностью активным размножающимся бактериям) до 10 8 (почти вся популяция состоит из NC бактерий).Примечательно, что бактерии pMind достигли наивысшего значения RI к 100-му дню хранения, тогда как в популяции pMind Rv2212 это состояние было достигнуто не ранее 180-го дня, что указывает на значимость экспрессии Rv2212 для поддержания активного роста при длительном хранении. Кроме того, как показано для бактерий дикого типа, наблюдалась четкая обратная корреляция между значением RI и содержанием цАМФ в бактериальных клетках, то есть постепенное увеличение бактериальной популяции, достигающей состояния NC во время длительного хранения (Рисунок 3B).

    Рисунок 3 . Развитие «некультивируемости» (A) и содержания цАМФ (B) из M. tuberculosis во время хранения неактивных бактерий. (A) M. tuberculosis pMind Rv2212 (темные кружки) или pMind (белые кружки), разработанные в среде Саутона, модифицированной «глицерином», выдерживали статически при комнатной температуре. Периодически отбирались образцы для оценки RI. (B) Микобактерии дикого типа выращивали и содержали в идентичных условиях для мониторинга внутриклеточных концентраций цАМФ и оценки RI.Указаны дни отбора проб. Эксперимент, показанный в (A) , был повторен дважды, показан один репрезентативный эксперимент. Результаты, представленные в (B) , отображают среднее значение из трех независимых экспериментов.

    Реанимация NC бактерий, развившихся в среде на основе глицерина (см. Рис. 2A, 180 дней), также оценивалась с использованием формата партии (Shleeva et al., 2013), когда идентичное количество бактерий инокулировалось в колбы, содержащие среду для реанимации. В этом эксперименте бактерии pMind Rv2212 демонстрировали значительно более короткую лаг-фазу и более быструю реанимацию по сравнению со штаммом pMind (фиг. 4).

    Рисунок 4 . Сверхэкспрессия Rv2212 приводит к более быстрой реанимации спящих M. tuberculosis . Некультивируемые Mtb pMind Rv2212 (темные кружки) или pMind (белые кружки), полученные из модифицированной среды Саутона «глицерин» после 180-дневной инкубации (см. Легенду к Фигуре 2A), промывали, инокулировали в среде для реактивации. и инкубировали при перемешивании (100 об / мин) при 37 ° C. Подробнее см. Материалы и методы.Эксперимент повторили два раза с аналогичными результатами.

    Инфекция, вызванная двумя штаммами микобактерий у мышей

    В предыдущих экспериментах мы и другие исследователи охарактеризовали фенотипы, контролируемые генами MSMEG_4279 и Rv2212 in vitro и в культивируемых инфицированных макрофагах. Чтобы изучить влияние сверхэкспрессии Rv2212 на характеристики bona fide туберкулеза, мышей двух инбредных линий, генетически устойчивых к туберкулезу B6 и гиперчувствительных I / St (Nikonenko et al., 2000), были инфицированы бактериями pMind , Rv2212 и pMind. Во-первых, мы получили косвенные доказательства вклада экспрессии AC в жизнеспособность микобактерий. Обычно в отсутствие специфической селекции микобактерии выбрасывают любую вставленную плазмиду, если кодирующий ген не обеспечивает какого-либо преимущества селекции. Для оценки стабильности присутствия плазмиды на 3-й неделе инфицирования гомогенаты легких высевали на агар Дубо и в полученных бактериальных колониях оценивали присутствие плазмиды в формате ПЦР.Даже в отсутствие отбора гигромицина все проанализированные колонии содержали плазмиду с интактной вставкой Rv2212, что убедительно свидетельствует о том, что сверхэкспрессия AC благоприятна для бактерий, размножающихся в хозяине. Этот вывод был дополнительно подтвержден наблюдением, что колонии pMind Rv2212 демонстрируют заметно увеличенные размеры по сравнению с колониями pMind, развивающимися в идентичных условиях (фиг. 5A). На ранней стадии инфекции (3 недели) количество КОЕ в легких у генетически восприимчивых мышей I / St было значительно ниже для штамма pMind по сравнению с pMind Rv2212 , тогда как генетически более устойчивые мыши B6 контролировали инфекцию, вызванную двумя микобактериальные штаммы одинаково хорошо (рис. 5B).Однако через 6 месяцев после заражения даже мыши B6 были неспособны контролировать рост штамма pMind Rv2212 в легких, чего не было в случае штамма pMind. Количество КОЕ в легких увеличилось на ~ 1 log по сравнению с 3-недельным подсчетом для штамма pMind Rv2212 , и значительные различия были также очевидны в селезенках (рис. 5C). Важно отметить, что в этом эксперименте количество КОЕ было идентичным для планшетов, содержащих гигромицин и не содержащих антибиотиков, подтверждая, что плазмида удерживалась бактериями на протяжении длительного хронического курса инфекции (данные не показаны).В соответствии с результатами оценки КОЕ микобактерий, кривые смертности, полученные на мышах B6, продемонстрировали, что штамм pMind Rv2212 был намного более вирулентным по сравнению с контрольным штаммом (Фиг.6).

    Рисунок 5 . M. tuberculosis pMind Rv2212 и фенотипы pMind экспрессировали in vivo . (A) Штамм pMind Rv2212 (слева), выделенный из легких, давал более крупные колонии по сравнению с контрольным штаммом (справа).Легкие инфицированных мышей B6 гомогенизировали, помещали на агар Dubos, выдерживали при 37 ° C в течение 3 недель и фотографировали. (B) Мышей инбредных линий I / St и B6 инфицировали 5 × 10 6 КОЕ M. tuberculosis pMind Rv2212 или pMind. На третьей неделе после инфицирования легкие гомогенизировали и серийные разведения наносили на среду Дубо. Результаты двух экспериментов с участием 4 мышей в каждом (всего N = 8) выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Значимая разница ( P <0.01, ANOVA) наблюдали между мышами B6, инфицированными pMind Rv2212 , и мышами I / St. (C) Через 6 месяцев после заражения наблюдались ~ 2 log различия ( P <0,001, ANOVA) между размножением микобактерий pMind Rv2212 и pMind в легких и селезенках мышей B6. Результаты выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( N = 6).

    Рисунок 6 . Кривая смертности для M. tuberculosis pMind Rv2212 — и мышей B6, инфицированных pMind.Мышей инбредной линии B6 инфицировали 5 × 10 6 КОЕ M. tuberculosis pMind Rv2212 (темные кружки) или pMind (белые кружки). Смертность контролировалась еженедельно.

    Обсуждение

    В этом исследовании мы представляем несколько линий доказательств, указывающих на важность экспрессии AC и продукции цАМФ для поддержания жизнеспособности Mtb в неблагоприятных для роста условиях. Во-первых, наблюдалась значительная разница в динамике роста in vitro между pMind Rv2212 , сверхэкспрессирующим AC, и контрольным штаммом, если развитие бактериальной популяции начиналось с небольшого количества предков (рис. 1).Такие культуры с «низким посевом» трудно выращивать (Мукамолова и др., 2002; Drancourt, Raoult, 2007) и чаще всего требуют дополнительных внешних факторов роста для инициации их активной репликации (Мукамолова и др., 2002). Напротив, если для инициации жидкой культуры микобактерий используется основной посевной материал, сверхэкспрессия гена Rv2212 не влияет на динамику роста (рис. S2). Как показано ранее, M. bovis BCG со сверхэкспрессией Rv2212 не продемонстрировали значительного различия в росте in vitro и по сравнению с бактериями дикого типа; однако в этом исследовании использовались только высокие исходные концентрации клеток.Примечательно, что этот штамм продемонстрировал значительное ускорение роста по сравнению с контрольным штаммом в макрофагах мыши, т.е. когда очевидны стрессовые условия для внутриклеточных паразитов (Pedroza-Roldán et al., 2015). Сходным образом сверхэкспрессия Rv2212 в M. smegmatis приводила к повышенной выживаемости бактерий в макрофагах (Ganaie et al., 2016).

    Во-вторых, важность продукции цАМФ была подтверждена в экспериментах по развитию покоящихся NC бактерий in vitro в условиях кислотного стресса.Сверхэкспрессия AC приводила к продлению способности бактерий образовывать КОЕ и к значительной задержке или даже предотвращению перехода бактерий в состояние покоя (рис. 2). В-третьих, повышенная экспрессия Rv2212 и продукция цАМФ существенно стимулировали восстановление M. tuberculosis из состояния NC и возобновление его активного роста (фиг. 4). Ранее мы обнаружили, что реанимация NC M. smegmatis вызывалась экзогенными жирными кислотами через активацию MSMEG_4279 (ортолог Rv2212 ) с последующим увеличением внутриклеточных концентраций цАМФ.Нокаутированный штамм M. smegmatis , лишенный MSMEG_4279 , не мог реанимировать в присутствии жирных кислот до добавления экзогенного цАМФ (Шлеева и др., 2013). Наконец, эксперименты in vivo и продемонстрировали, что повышенный уровень экспрессии AC (и, очевидно, продукции цАМФ) в мутанте стимулировал размножение Mtb в органах мыши.

    Последний результат резко контрастирует с наблюдениями Педрозы-Ролдана и др.(2015) в отношении штамма BCG-Rv2212 , который демонстрировал почти идентичный рост с контрольным штаммом в органах мыши. Мы подозреваем, что это различие может быть связано с различным расположением Mtb и M. bovis BCG в клетках-хозяевах.

    Было установлено, что высоковирулентные виды микобактерий, например M. tuberculosis и M. leprae , легко мигрируют из фагосом в цитозоль миелоидных клеток и продолжают свою репликацию в этом новом клеточном компартменте (van der Wel et al., 2007). Тот факт, что эта миграция в значительной степени зависит от белка ESAT-6, который нарушает сигнальный путь TLR2-MyD88 в клетках-хозяевах, важен для предотвращения миграции микобактерий из фагосом (Rahman et al., 2014). В геномах подавляющего большинства невирулентных или низковирулентных микобактерий, включая БЦЖ, отсутствует секреторная система RD1, которая содержит гены основных факторов вирулентности ESAT-6 и cfp10 (van Ingen et al., 2009), и очень большая часть общей бактериальной популяции действительно находится в фагосомах макрофагов.Различия во внутриклеточных концентрациях цАМФ могут по-разному влиять на выживаемость микобактерий, находящихся в компартментах фагосомы и цитозоля.

    Относительно умеренное увеличение концентраций цАМФ (~ 2,5 раза) оказалось достаточным, чтобы вызвать многочисленные стимулирующие рост эффекты сверхэкспрессии AC, описанные выше. Причина, по которой такое незначительное увеличение приводит к значительным изменениям в физиологии бактерий, неясна, учитывая, что во время длительного хранения концентрации цАМФ упали в 10 раз, в то время как количество бактерий NC показало изменения примерно в 5 логарифмов (рис. 3B).Одна из возможностей состоит в том, что существует критический порог для концентраций цАМФ (18–20 пмоль на 1 мг сырого веса), ниже которого бактерии быстро приобретают фенотип NC, но даже умеренного увеличения концентрации цАМФ достаточно для реанимации и роста. Наши более ранние результаты, демонстрирующие быстрое увеличение содержания цАМФ на начальной стадии реанимации M. smegmatis , подтверждают этот вывод (Shleeva et al., 2013).

    Существует достаточно доказательств того, что продукция цАМФ важна для выживания патогена в клетках-хозяевах.Таким образом, высокие количества цАМФ, секретируемые Mtb в макрофагах, модулируют слияние фагосома-лизосома, тем самым увеличивая выживаемость микобактерий (Kalamidas et al., 2006). «Интоксикация» макрофагов высокими концентрациями цАМФ может положительно влиять на выживаемость микобактерий (Agarwal et al., 2009). цАМФ влияет на экспрессию генов, участвующих в ответе микобактерий на гипоксические условия, часто представляющие in vivo (Gazdik and McDonough, 2005). Высокие концентрации цАМФ повышают устойчивость микобактерий к стрессовым условиям за счет повышения экспрессии шоковых белков GroEL и DnaK (Pedroza-Roldán et al., 2015). Кроме того, цАМФ напрямую регулирует активность таких ферментов, как малатдегидрогеназа (Gazdik and McDonough, 2005) и лизинацетилаза (Rv0998) (Knapp and McDonough, 2014), участвующих в центральных метаболических путях микобактерий (Xu et al., 2011). Эти разнообразные эффекты могут правдоподобно объяснить лучшую выживаемость штамма , гиперэкспрессирующего Rv2212 , in vivo .

    Основываясь на данных in vitro и , мы предполагаем, что высокий уровень цАМФ препятствует переходу бактерий в состояние покоя и развитию латентно-подобного заболевания in vivo .Необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы выяснить эту возможность, тем более что штамм pMind Rv2212 продемонстрировал повышенную вирулентность как у генетически чувствительных к ТБ, так и у устойчивых к ТБ мышей (рисунки 5, 6). Это важное наблюдение, предполагающее, что либо микобактериальный AC, либо биохимические каскады выше AC могут рассматриваться в качестве мишени для новых противотуберкулезных препаратов.

    Также следует отметить, что молекулярные механизмы, повышающие жизнеспособность микобактерий при повышенных концентрациях цАМФ, остаются неясными.Значение внутриклеточного цАМФ как вторичного посредника для широкого спектра бактериальных биохимических процессов хорошо установлено (Baker and Kelly, 2004), но специфические последующие процессы, связывающие уровни цАМФ и жизнеспособность бактерий на уровне транскрипции, четко не определены. Были описаны два транскрипционных фактора, воспринимающих цАМФ внутри клетки: CRP Mt (Rv3676) и Cmr (Rv1675c) (Knapp and McDonough, 2014). Было продемонстрировано, что Cmr имеет более 300 сайтов связывания вдоль бактериальной хромосомы и, таким образом, потенциально может участвовать в регуляции широкого спектра метаболических процессов.В контексте настоящей работы стоит упомянуть, что цАМФ модулирует связывание Cmr с генами, принадлежащими регулону DosR, что важно для выживания Mtb в условиях гипоксии в нереплицирующемся состоянии (Ranganathan et al., 2016) . CRP Mt также проявляет плеотропные эффекты, включая контроль биосинтеза аминокислот (Bai et al., 2011), экспрессию гена RpfA , кодирующего фактор, способствующий реанимации микобактерий (Mukamolova et al., 2003; Рикман и др., 2005; Шлеева и др., 2013) и экспрессия сукцинатдегидрогеназы (Rv0247c-Rv0249c) (Knapp et al., 2015).

    Наше исследование ясно демонстрирует, что повышенная продукция цАМФ из-за активности АС, зависящей от Rv2212 , играет «противодействующую» роль, поддерживая при неблагоприятных условиях активное состояние Mtb в культуре и его размножение внутри хозяина. Точная метаболическая структура этой «поддерживающей жизнеспособность» оси еще предстоит определить.

    Взносы авторов

    AK и MS задумали и спланировали эксперименты. MS, GD и AG провели эксперименты in vitro . TK и ER выполнили эксперименты in vivo . AK, MS и AA проанализировали данные. MS подготовила рисунки и графики. Рукопись написали AK, MS и AA. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи. AK, MS и AA отредактировали рукопись.

    Заявление о конфликте интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Благодарности

    Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Российского научного фонда 16-15-00245 (для AK, исследований in vitro, ) и 15-15-30020 (для TK, исследований in vivo, ). Мы благодарим доктора Брайана Робертсона за предоставленную плазмиду pMind.

    Дополнительные материалы

    Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fcimb.2017.00370/full#supplementary-material

    Рисунок S1 .Уровни цАМФ в различных штаммах M. tuberculosis , выращенных на среде Саутона в течение 8 дней. Рекомбинантный штамм M. tuberculosis , содержащий вектор pMind Rv2212 или пустой вектор pMind, культивировали в стандартной среде Саутона при перемешивании (200 об / мин) при 37 ° C в течение 8 дней. В некоторых экспериментах к среде добавляли гидрохлорид тетрациклина до конечной концентрации 20 нг на мл. Результаты отображают среднее значение трех независимых экспериментов.

    Рисунок S2 .Выращивание различных штаммов M. tuberculosis в стандартной среде Саутона из инокулята 10 5 . Рекомбинантный штамм M. tuberculosis , содержащий вектор pMind Rv2212 (темные кружки) или пустой вектор pMind (белые кружки), культивировали в стандартной среде Саутона при перемешивании (200 об / мин) при 37 ° C. Исходный размер посевного материала составлял 10 5 бактерий на мл. Этот эксперимент был повторен 3 раза с аналогичными результатами, показан один репрезентативный эксперимент.

    Список литературы

    Абдель Мотаал, А., Тьюс, И., Шульц, Дж. Э. и Линдер, Дж. У. (2006). Жирнокислотная регуляция аденилатциклазы Rv2212 из Mycobacterium tuberculosis h47Rv. FEBS J. 273, 4219–4228. DOI: 10.1111 / j.1742-4658.2006.05420.x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Агарвал, Н., Ламичхан, Г., Гупта, Р., Нолан, С., и Бишай, В. Р. (2009). Циклическая интоксикация макрофагов АМФ аденилатциклазой Mycobacterium tuberculosis . Природа 460, 98–102. DOI: 10.1038 / nature08123

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бай, Г., Шаак, Д. Д., Смит, Э. А., и МакДонаф, К. А. (2011). Нарушение регуляции биосинтеза серина способствует дефекту роста мутанта Mycobacterium tuberculosis crp. Мол. Microbiol. 82, 180–198. DOI: 10.1111 / j.1365-2958.2011.07806.x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бейкер, Д.А. и Келли Дж. М. (2004). Структура, функция и эволюция микробных аденилил- и гуанилилциклаз. Мол. Microbiol. 52, 1229–1242. DOI: 10.1111 / j.1365-2958.2004.04067.x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Barry, C.E. III., Boshoff, H. I., Dartois, V., Dick, T., Ehrt, S., Flynn, J., et al. (2009). Спектр латентного туберкулеза: переосмысление биологии и стратегии вмешательства. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845–855.DOI: 10.1038 / nrmicro2236

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Коннелл, Н. Д. (1994). Mycobacterium : выделение, поддержание, трансформация и отбор мутантов. Methods Cell Biol. 45, 107–125.

    PubMed Аннотация | Google Scholar

    де Ман, Дж. К. (1975). Вероятность наиболее вероятных чисел. Eur. J. Appl. Microbiol. 1, 67–78.

    Google Scholar

    Ганая, А.А., Триведи, Г., Каур, А., Джа, С. С., Ананд, С., Рана, В. и др. (2016). Взаимодействие белка Erp Mycobacterium tuberculosis с Rv2212 увеличивает внутриклеточную выживаемость Mycobacterium smegmatis . J. Bacteriol. 198, 2841–2852. DOI: 10.1128 / JB.00120-16

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Газдик, М. А., и МакДонаф, К. А. (2005). Идентификация генов, регулируемых циклическим АМФ, в комплексных бактериях Mycobacterium tuberculosis в условиях низкого содержания кислорода. J. Bacteriol. 187, 2681–2692. DOI: 10.1128 / JB.187.8.2681-2692.2005

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Каламидас, С.А., Кюхнель, М.П., ​​Пейрон, П., Рыбин, В., Раух, С., Котулас, О.Б., и др. (2006). Синтез и деградация цАМФ фагосомами регулируют процессы сборки и слияния актина: последствия для микобактерий. J. Cell Sci. 119, 3686–3694. DOI: 10.1242 / jcs.03091

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кнапп, Г.С., Любецкая А., Петерсон М. В., Гомес А. Л., Ма З., Галаган Дж. Э. и др. (2015). Роль внутригенного связывания цАМФ-зависимого белка (CRP) в регуляции генов сукцинатдегидрогеназы Rv0249c-Rv0247c в микобактериях комплекса TB. Nucleic Acids Res. 43, 5377–5393. DOI: 10.1093 / nar / gkv420

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мукамолова Г. В., Капрелянц А. С., Келл Д. Б., Янг М. (2003). Принятие временно некультивируемого состояния — стратегия выживания бактерий? Adv.Microb. Physiol. 47, 65–129. DOI: 10.1016 / S0065-2911 (03) 47002-1

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мукамолова Г. В., Турапов О. А., Янг Д. И., Капрелянц А. С., Келл Д. Б., Янг М. (2002). Семейство аутокринных факторов роста в Mycobacterium tuberculosis . Мол. Microbiol. 46, 623–635. DOI: 10.1046 / j.1365-2958.2002.03184.x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Никоненко, Б.В., Авербах, М. М. младший, Лавебрат, К., Шурр, Э. и Апт, А. С. (2000). Сравнительный анализ микобактериальных инфекций у инбредных мышей, чувствительных к I / St и устойчивых к A / Sn. Клубень. Lung Dis. 80, 15–25. DOI: 10.1054 / tuld.1999.0225

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Педроса-Ролдан, К., Асевес-Санчес, М. Дж., Завери, А., Чарльз-Ниньо, К., Элизондо-Кирога, Д. Э., Эрнандес-Гутьеррес, Р. и др. (2015). Аденилилциклаза Rv2212 модифицирует протеом и инфекционность Mycobacterium bovis BCG. Folia Microbiol. 60, 21–31. DOI: 10.1007 / s12223-014-0335-1

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Рахман В. Ф., Собия П., Гупта Н., Каер Л. В. и Дас Г. (2014). Mycobacterium tuberculosis разрушает путь TLR-2 — MyD88 для облегчения его транслокации в цитозоль. PLoS ONE 9: e86886. DOI: 10.1371 / journal.pone.0086886

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ранганатан, С., Бай Г., Любецкая А., Кнапп Г. С., Петерсон М. В., Газдик М. и др. (2016). Характеристика фактора транскрипции, отвечающего за цАМФ, Cmr (Rv1675c), у комплексных микобактерий TB, выявляет перекрытие с регулятором покоя DosR (DevR). Nucleic Acids Res. 44, 134–151. DOI: 10.1093 / nar / gkv889

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Рикман Л., Скотт К., Хант Д. М., Хатчинсон Т., Менендес М. К., Валан Р. и др. (2005). Член семейства белков рецептора цАМФ регуляторов транскрипции Mycobacterium tuberculosis необходим для вирулентности у мышей и контролирует транскрипцию гена rpfA, кодирующего фактор, способствующий реанимации. Мол. Microbiol. 56, 1274–1286. DOI: 10.1111 / j.1365-2958.2005.04609.x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Шлеева М. О., Баграмян К., Телков М. В., Мукамолова Г. В., Янг М., Келл Д. Б. и др. (2002). Формирование и реанимация «некультивируемых» клеток Rhodococcus rhodochrous и Mycobacterium tuberculosis в длительной стационарной фазе. Микробиология 148, 1581–1591. DOI: 10.1099 / 00221287-148-5-1581

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Шлеева М.О., Кудыкина Ю.К., Вострокнутова Г.Н., Сузина Н.Е., Мулюкин А.Л., Капрельянц А.С. (2011). Спящие яйцевидные клетки Mycobacterium tuberculosis образуются в ответ на постепенное внешнее закисление. Туберкулез 91, 146–154. DOI: 10.1016 / j.tube.2010.12.006

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Шлеева М., Гончаренко А., Кудыкина Ю., Янг Д., Янг М., Капрелянц А. (2013). Циклическое AMP-зависимое оживление покоящихся микобактерий экзогенными свободными жирными кислотами. PLoS ONE 8: e82914. DOI: 10.1371 / journal.pone.0082914

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    van der Wel, N., Hava, D., Houben, D., Fluitsma, D., van Zon, M., Pierson, J., et al. (2007). M. tuberculosis и M. leprae перемещаются из фагосомы в цитозоль миелоидных клеток. Ячейка 129, 1287–1298. DOI: 10.1016 / j.cell.2007.05.059

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    ван Инген, Дж., Zwa, R., Dekhuijzen, R., Boeree, M., and van Soolingen, D. (2009). Область различия 1 у нетуберкулезных видов Mycobacterium добавляет филогенетический и таксономический характер. J. Bacteriol. 191, 5865–5867. DOI: 10.1128 / JB.00683-09

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сюй Х., Хегде С.С. и Бланшар Дж. С. (2011). Обратимое ацетилирование и инактивация ацетил-КоА синтетазы Mycobacterium tuberculosis зависит от цАМФ. Биохимия 50, 5883–5892. DOI: 10.1021 / bi200156t

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Внутригенный локус в гене PIWIL2 человека разделяет функции промотора и энхансера

    Abstract

    Недавно было накоплено больше доказательств, подтверждающих общую природу промоторов и энхансеров. В этой работе мы представляем данные о модификациях хроматина и характеристиках неполиаденилированной транскрипции для энхансеров, а также результаты анализов репортера люциферазы in vitro in vitro, предполагающие, что альтернативный промотор PIWIL2 в экзоне 7 также функционирует как энхансер для гена PHYHIP расположен в 60Кб выше по течению.Это открытие внутригенного энхансера, служащего промотором для более короткой изоформы белка, подразумевает более широкое влияние на понимание сетей энхансер-промотор в регуляции экспрессии генов.

    Образец цитирования: Скворцова Ю.В., Кондратьева С.А., Зиновьева М.В., Николаев Л.Г., Ажикина Т.Л., Гайнетдинов И.В. (2016) Интрагенный локус в функциях промотора и энхансера гена PIWIL2 человека. PLoS ONE 11 (6): e0156454. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454

    Редактор: Микела Гроссо, Неаполитанский университет имени Федерико II, ИТАЛИЯ

    Поступила: 29 января 2016 г .; Принят в печать: 13 мая 2016 г .; Опубликован: 1 июня 2016 г.

    Авторские права: © 2016 Скворцова и др. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

    Финансирование: Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований №

    . 14-04-32314-мол_а в ЯВС и программе Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология». Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

    Введение

    Регуляция экспрессии генов — это многослойный процесс, который включает такие аспекты, как промоторы, энхансеры, факторы транскрипции, модификации хроматина и пространственная организация ядра. Все эти составляющие взаимодействуют посредством перекрестных помех, и их сложное взаимодействие приводит к различным паттернам экспрессии в ряде тканей и типов клеток [1–3]. Тем не менее, недавние успехи в исследованиях регуляции транскрипции выявили общие черты, характерные для сайтов активной экспрессии генов: совместная локализация транскрибируемых генов на фабриках транскрипции [4, 5], взаимодействие нескольких энхансеров с несколькими промоторами внутри топологически ассоциирующих доменов (TAD) [6] , аналогичные модификации хроматина внутри TAD [7–10], транскрипция инициируется на энхансерах (энхансерная РНК, эРНК) [11, 12].Другое новое понимание — это общая архитектура промоторов и энхансеров как платформ для инициации транскрипции, ведущая к относительно стабильной кодирующей белок мРНК и временной эРНК, соответственно [13-15]. Эти данные указывают на тот факт, что энхансеры потенциально могут действовать как промоторы и наоборот, при правильной клеточной среде. Среди таких ранее описанных случаев — энхансеры мышиного альфа-глобинового локуса, расположенные в интронах гена Nprl3 , которые действуют как альтернативные промоторы для этого гена, давая начало новым продуктам мРНК [16].Однако альтернативных белковых продуктов в этом случае не обнаружено. Дальнейший полногеномный анализ транскриптома показал, что до 50% внутригенных энхансеров инициируют транскрипцию эРНК и почти 10% продуцируют альтернативные варианты мРНК для соответствующих генов в эритроидных клетках мышей [16]. Кроме того, от 1% до 7,5% активных сайтов начала транскрипции (TSS) имеют очевидные модификации хроматина энхансера в линиях клеток человека [16].

    В этой работе мы сообщаем набор как косвенных, так и прямых доказательств, демонстрирующих аналогичную настройку для человеческого семенникового гена PIWIL2 , который является центральным участником пути piRNA / PIWI, ответственного за эпигенетическое молчание ретротранспозонов [17, 18].В частности, описанный ранее альтернативный промотор PIWIL2 в экзоне 7, по-видимому, способен действовать как энхансер для гена PHYHIP , расположенного на 60 т.п.н. Хотя PHYHIP высоко экспрессируется в тканях мозга [19] и, как предполагается, играет роль в развитии неврологических аномалий, наблюдаемых у пациентов с синдромом Дауна [20], он также коэкспрессируется с PIWIL2 в тканях семенников [21]. , 22]. Взятые вместе, это наблюдение подразумевает, что переключение между функциями энхансера и промотора может влиять как на экспрессию мРНК, так и на экспрессию белков некоторых генов.

    Методы и материалы

    Заявление об этике

    Семь пар образцов опухолей семенных клеток яичка и соответствующие прилегающие нормальные паренхимы яичка были получены из образцов орхиэктомии. Образцы немедленно замораживали в жидком азоте. Все пациенты предоставили письменное информированное согласие в соответствии с федеральным законом, и исследование было одобрено этическими комитетами Института биоорганической химии им. Шемякина-Овчинникова РАН и РОНЦ им. Блохина после рассмотрения форм согласия и информации пациентов. .

    Клеточные линии

    Клеточные линии, использованные в экспериментах, включали TERA1 (ATCC HTB-105, эмбриональная карцинома яичка [23]), NT2 / D1 (ATCC CRL-1973, плюрипотентная эмбриональная карцинома яичка [24]) и A549 (ATCC CCL-185, карцинома легкого [ 25]). Культуры клеток приобретали в ATCC (США) и выращивали в среде DMEM / F12 (1: 1) (Invitrogen, США) с добавлением 10% FCS (Invitrogen, США). Клеточная линия TCam-2 [26] была любезно предоставлена ​​профессором доктором Хюбертом Шорле (отделение патологии развития, Институт патологии, Боннская медицинская школа, Германия).Клетки TCam-2 культивировали в среде RPMI 1640 (Invitrogen, США) с добавлением 10% FCS (Invitrogen, США).

    Иммунопреципитация хроматина

    ChIP выполняли, как описано ранее [27, 28], с использованием антител к модификациям гистонов человека, перечисленных в таблице S1. ДНК очищали с помощью набора для очистки QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, США). КПЦР проводили с использованием системы qPCRmix-HS SYBR (Евроген, Россия) на Lightcycler 480 (Roche, США) в соответствии с инструкциями производителей. Фрагменты ДНК амплифицировали в течение 40 циклов: 95 ° C в течение 20 с, 60 ° C в течение 20 с, 72 ° C в течение 20 с.Относительный уровень модификации хроматина определяли количественно, используя «входной контроль» в качестве эталона. Биологические и технические дубликаты были использованы для обеспечения воспроизводимости. Пары праймеров, использованные при амплификации, перечислены в таблице S2.

    qRT-PCR

    Экстракцию и очистку тотальной РНК из клеточных линий, TGCT и нормальных образцов семенников проводили с помощью Trizol (Thermo Scientific, США) в соответствии с инструкциями производителя. Синтез первой цепи кДНК проводили с использованием либо случайного гексануклеотида (Promega, США), либо праймера олиго-dT (5’-dT 20 V-3 ’) и транскриптазы MintReverse (Евроген, Россия) согласно протоколам производителей.Реакции qRT-PCR проводили с использованием системы qPCRmix-HS SYBR (Евроген, Россия) на Lightcycler 480 (Roche, США) в соответствии с инструкциями производителей. Фрагменты ДНК амплифицировали в течение 40 циклов: 95 ° C в течение 20 с, 60 ° C в течение 20 с, 72 ° C в течение 20 с. Относительный уровень мРНК количественно определяли с использованием мРНК бета-актина (ген ACTB ) в качестве эталона. Технические трижды использовались для обеспечения воспроизводимости. Пары праймеров, используемые при амплификации, перечислены в таблице S3.

    Люциферазные репортерные векторы, трансфекция и анализ репортерного гена

    Геномную ДНК

    экстрагировали из одного из нормальных образцов семенников с помощью набора для очистки геномной ДНК Wizard (Promega, США).Геномные области были амплифицированы с использованием праймеров, перечисленных в таблице S4. Продукты ПЦР лигировали в pGL4.10 [luc2], pGL4.13 [luc2 / SV40] или pGL4.10mP2 (файл S1) с ДНК-лигазой Т4 (Thermo Scientific, США): в качестве промоторов — между сайтами NheI и BglII, в качестве энхансеров. –В любой ориентации на сайте NotI. Перед трансфекцией конструкции линеаризовали рестрикционными ферментами PvuI или SalI для прямой и обратной ориентации соответственно. Контроли «без энхансера» также были линеаризованы с помощью тех же рестрикционных ферментов.Трансфекцию проводили с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Клетки лизировали через 24 часа после трансфекции, и активность люцифераз светлячка и Renilla reniformis оценивали с использованием системы DualLuciferase Reporter Assay System (Promega, США) и люминометра Tecan GENios Pro (MTX Lab Systems, США) в соответствии с протоколами производителей. . Биологические и технические дубликаты были использованы для обеспечения воспроизводимости.

    Результаты и обсуждение

    In silico доказательства для областей вокруг PIWIL2 экзонов 5 и 7, действующих как энхансеры

    PIWIL2 — это тестикоспецифический белок, участвующий в пути piRNA, который регулирует экспрессию ретротранспозонов в сперматогенезе [17].Ye et al. ранее сообщали об альтернативных промоторах гена PIWIL2 , которые они идентифицировали компьютерным путем [29]. Наша группа также картировала альтернативные сайты начала транскрипции в PIWIL2, экзонах 5 и 7 в линиях клеток рака яичка TERA1 и NT2D1, используя традиционные подходы молекулярной биологии [30].

    Важно отметить, что альтернативные промоторы в экзонах 5 и 7 были также идентифицированы консорциумом FANTOM5 в тканях, не являющихся тестикулярными, в их экспериментах CAGE (S1 Fig) [31].Кроме того, при анализе треков состояния хроматина на основе 127 образцов в Roadmap Epigenomics Project [32] были обнаружены дополнительные доказательства: область около PIWIL2 экзон 7 содержит эпигенетические метки промотора в 10 первичных и 4 вмененных наборах данных (S2 и S3, рис. соответственно). В целом, эти результаты обеспечивают дополнительную поддержку наших открытий PIWIL2 альтернативных промоторов в линиях клеток рака яичка.

    Однако более тщательное изучение данных проекта Roadmap Epigenomics показало, что между 6 и 28 первичными наборами данных (S2 рис.) И между 44 и 55 вмененными наборами данных (S3 рис.) Отображены комбинации эпигенетических меток около PIWIL2 экзонов 1 5 и 7, характерные для энхансеров.Более того, данные ENCODE также предполагают, что альтернативных промоторов PIWIL2 как в экзонах 5, так и в 7 могут функционировать как энхансеры [33]. В частности, пики h4K4me1 были обнаружены в наборах данных ENCODE для клеточных линий уровня 1 и 2 (рис. S4 и S5). Кроме того, сайты связывания для белков, обычно связанных с энхансерами, такими как CTCF [34, 35] и P300 [36], также расположены рядом с альтернативными промоторами в экзонах 5 и 7 (S4 Fig) [37-39]. Кроме того, существует ряд предполагаемых мотивов связывания факторов транскрипции вокруг этих промоторов (S5 фиг.) И значительное количество как тканеспецифичных, так и повсеместно экспрессируемых факторов транскрипции, связанных в различных клеточных линиях, согласно экспериментам ENCODE ChIP-seq (S5 фиг.).

    Мы дополнительно изучили треки данных сегментации генома ENCODE, которые были сгенерированы для 6 клеточных линий с использованием различных методов (S4 Fig, [40–43]): по крайней мере, один метод назначил область вокруг промотора в экзоне 7 в качестве энхансера для всех 6 клеточных линий. и для 2 клеточных линий в случае промоторов в экзонах 1 и 5 соответственно (S4 фиг.).

    В целом, имеется значительное количество доказательств, позволяющих предположить, что промоторы PIWIL2 в экзонах 5 и 7 также могут функционировать как энхансеры.Чтобы проверить, так ли это в тканях и клеточных линиях семенников, мы рассмотрели три свойства энхансеров: продукцию эРНК (связанную с некоторыми энхансерами), специфические модификации хроматина и способность увеличивать активность промотора независимо от ориентации [43–47] .

    Модификации хроматина вокруг

    Альтернативного промотора PIWIL2 в экзоне 7 характерны для активных энхансеров

    Исследования полного генома приписывают определенные модификации хроматина энхансерным элементам: h4K4me1 / h4K27ac для активных энхансеров и h4K4me1 / h4K27me3 для сбалансированных / неактивных энхансеров, в отличие от h4K4me3 для промоторов [48].Чтобы увидеть, присутствуют ли эти особенности в каноническом промоторе PIWIL2 в экзоне 1 и альтернативных промоторах в экзонах 5 и 7, мы провели эксперименты ChIP с антителами к этим модификациям на трех клеточных линиях, связанных с раком яичка (TCam-2 — производное семиномы, TERA1 и NT2D1 –эмбриональная карцинома) и одна клеточная линия карциномы легкого (A549). Промотор GAPDH (ген домашнего хозяйства) использовали в качестве положительного контроля, а интрон 8 PIWIL2 , а также межгенный локус на хромосоме 1 — в качестве отрицательного контроля.

    Интересно, что хотя канонический промотор PIWIL2 в экзоне 1 содержит модификации гистонов, характерные как для промоторов (h4K4me3), так и для энхансеров (h4K4me1) во всех протестированных клеточных линиях, он, вероятно, будет неактивен из-за присутствия молчащей метки h4K27me3 ( Рисунок 1). Отсутствие промоторной активности в экзоне 1 также подтверждается предыдущими открытиями, показывающими, что PIWIL2 экспрессируется в виде его N-усеченных изоформ белка в большинстве клеточных линий и раковых тканей [29, 30].

    Рис. 1. Модификации хроматина вокруг канонических и альтернативных промоторов PIWIL2 .

    Относительный уровень h4K4me1 (гистон 3 лизин 4 монометилированный, энхансерная метка), h4K4me3 (гистон 3 лизин 4 триметилированный, активный промоторный знак), h4K27ac (гистон 3 лизин 27 ацетилированный, метка активного регуляторного элемента) и h4K27me3 (гистон 3 лизин 27 триметилированные, факультативные метки гетерохроматина) модификации гистонов, оцененные с помощью ChIP-PCR с двумя наборами пар праймеров вокруг канонического промотора PIWIL2 в экзоне 1 и альтернативных промоторов в экзонах 5 и 7.Результаты показаны для четырех клеточных линий: TERA1 и NT2D1 –эмбриональная карцинома, TCam2 –семинома и A549 – карцинома легкого. Отрицательные контроли — это интрон 8 PIWIL2, и межгенный локус на хромосоме 1, положительный контроль — промотор GAPDH . Сводная информация о P-значении непарного U-критерия Манна-Уитни представлена ​​для некоторых пиков (ns — несущественно, * — p-значение <0,05, ** - p-значение <0,01).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454.g001

    Кроме того, в отличие от области генома вокруг экзона 5, альтернативный промотор в экзоне 7 демонстрирует статистически значимое обогащение метки h4K4me1 по сравнению с отрицательными контролями во всех случаях. линии клеток, кроме TCam-2 (рис. 1).Более того, уровень меток h4K27ac вокруг экзона 7 также выше, чем в отрицательном контроле (рис. 1), что позволяет предположить, что он может быть активно функционирующим энхансером, по крайней мере, в клеточных линиях TERA1, NT2D1 и A549.

    PIWIL2 Альтернативные промоторы в экзонах 5 и 7 продуцируют большое количество неполиаденилированных транскриптов

    Недавно было обнаружено, что некоторые энхансеры транскрибируются с помощью Pol II и продуцируют эРНК (энхансерная РНК), которые представляют собой либо полиаденилированные, либо неполиаденилированные короткие транскрипты (как сплайсированные, так и не сплайсированные), возникающие вокруг энхансеров в одном или двух направлениях [49].В одном из первых исследований, сообщающих о продукции неполиаденилированной эРНК, эти транскрипты, связанные с энхансером, были идентифицированы путем анализа общей РНК [50]. Поэтому мы попытались использовать аналогичный подход и оценили наличие неполиаденилированной транскрипции около альтернативных промоторов PIWIL2 с помощью qRT-PCR на общей РНК и сравнили ее с результатами для ее фракции polyA +. Мы разработали 15 пар праймеров, равномерно покрывающих всю длину гена PIWIL2 и специфически нацеленных на соединения экзон-экзон, чтобы минимизировать вклад возможной остаточной геномной ДНК в образцах.Результаты нормализовали по эффективности каждой пары праймеров и рассчитывали отношение общей РНК к фракции полиА +. Таким образом, мы установили профиль транскрипции вдоль гена и вклад неполиаденилированных транскриптов в каждой точке гена PIWIL2 .

    Результаты для 7 нормальных / опухолевых пар образцов рака яичка (как семиноматозных, так и несеминоматозных) довольно неоднородны (рис. 2 и рис. S6), что согласуется с ранее опубликованными данными, показывающими, что как нормальные ткани яичка, так и рак яичка имеют значительную вариабельность среди людей [51].Однако данные ясно демонстрируют, что все образцы опухолей и некоторые прилегающие нормальные ткани семенников имеют заметные и статистически значимые пики для некоторых соединений экзонов, особенно 4–5 и 8–9 (рис. 2 и S6, рис.). Менее выраженная, но аналогичная картина наблюдалась для клеточных линий TERA1, NT2D1 и A549 (S7 фиг.). Это открытие, по-видимому, указывает на присутствие значительной фракции неполиаденилированных транскриптов вокруг экзонов 5 и 7, которые могут быть транскриптами эРНК.

    Рис 2.Неполиаденилированная транскрипция между экзон-экзонными соединениями гена PIWIL2 .

    qRT-PCR использовали для оценки уровня общей РНК и ее фракции полиА + и рассчитывали отношение общей РНК к фракции полиА +. Были исследованы образцы семиномного и несеминомного рака яичка, а также прилегающие нормальные ткани яичка. Сводная информация о P-значении непарного U-критерия Манна-Уитни представлена ​​для 4–5 и 8–9 пиков экзон-экзонных соединений (нс — незначимо, *** — p-значение <0,001).

    https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0156454.g002

    Анализы репортера люциферазы демонстрируют, что альтернативный промотор

    PIWIL2 в экзоне 7 может функционировать как энхансер для промотора гена PHYHIP

    Хотя модификации хроматина и продукция эРНК рассматриваются как косвенные доказательства, существенным свойством энхансера является повышение активности промотора в зависимости от типа клетки [47]. Чтобы проверить, могут ли канонические и альтернативные промоторы PIWIL2 действовать в качестве энхансеров, мы клонировали их в обеих ориентациях в репортерные векторы люциферазы ниже гена luc , управляемого промотором SV40 или CMV (рис. ) и эквимолярные количества конструкций зондировали в двух клеточных линиях (TERA1 и NT2D1).Важно отметить, что ранее было показано, что участки генома, которые мы тестировали на свойства энхансеров, также обладают промоторной активностью. Поэтому, чтобы различать свойства промотора и энхансера, мы линеаризовали репортерные векторы люциферазы, разрезая их ниже (прямая ориентация) или выше (обратная ориентация) сайта, в который мы поместили исследуемые энхансеры-кандидаты (рис. 3). Важно отметить, что после линеаризации энхансер-кандидат будет располагаться либо ниже (прямая ориентация), либо выше (обратная ориентация) репортерного гена люциферазы с промотором (рис. 3).Это позволяет нам проверить другой аспект функции энхансера: способность увеличивать активность промотора независимо от его положения (выше или ниже по течению).

    Рис. 3. Структура репортерных векторов люциферазы, используемых в анализах. Плазмиду

    pGL4.10 использовали для конструирования векторов с экспрессией гена luc , управляемой различными промоторами (верхняя часть в скобках) и кандидатным энхансером в любой ориентации (нижняя часть). Поскольку кандидаты в энхансеры также обладают промоторной активностью, чтобы различить их, векторы были линеаризованы путем разрезания участков, показанных красными стрелками.Обратите внимание, что после такой линеаризации энхансер-кандидат будет располагаться либо выше (обратная ориентация), либо ниже (прямая ориентация) гена luc и его промотора.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454.g003

    Интересно, что более чем двукратное увеличение активности только промотора CMV и исключительно в клеточной линии NT2D1 было обнаружено для области генома PIWIL2 вокруг экзона. 7 (рис. 4A), что подтверждает его способность действовать как энхансер.

    Рис. 4. PIWIL2 Альтернативный промотор в экзоне 7 действует как энхансер в репортерных конструкциях люциферазы.

    Относительную промоторную активность промоторов SV40 и CMV оценивали в репортерных векторах люциферазы из фиг. 3 в двух клеточных линиях: TERA1 и NT2D1 (эмбриональная карцинома, панель A). Промоторы PPP3CC и PHYHIP (панель B) оценивали в репортерных векторах люциферазы из фиг. 3 в четырех клеточных линиях: TERA1 и NT2D1 –эмбриональная карцинома, Tcam2 –семинома и A549 – карцинома легкого.Сводка P-значения непарного U-критерия Манна-Уитни представлена ​​для пиков, показывающих более чем двукратное увеличение (над горизонтальными пунктирными линиями) как для прямой, так и для обратной ориентации кандидата в энхансер по сравнению с контролями без энхансера (* — p-значение <0,05, ** - p-значение <0,01).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454.g004

    Мы также хотели найти in vivo мишень этого энхансера / альтернативного промотора в экзоне 7 PIWIL2 .Поскольку большинство энхансеров проявляют свою активность в пределах примерно 100Kb и обычно внутри топологически ассоциированного домена (TAD) [52], мы рассмотрели недавно созданную карту геномных взаимодействий с разрешением в килобазах Hi-C (S8 Fig, [53]). PIWIL2 расположен в границах контактного домена, также содержащего гены POLR3D (субъединица РНК-полимеразы III [54]) и PHYHIP (белок, взаимодействующий с фитаноил-CoA 2-гидроксилазой [19]) (S8 Fig). Были сконструированы репортерные векторы люциферазы с экспрессией гена luc , управляемой этими промоторами (S9 фиг.), И геномной областью вокруг экзона 7 PIWIL2 в качестве кандидата в энхансер.Также были использованы еще две контрольные конструкции с кандидатным энхансером и экспрессией luc , управляемой промоторами двух генов, расположенных за пределами PIWIL2 , содержащего контактный домен (S8 и S9 фиг.): KIAA1967 (Регулятор клеточного цикла и апоптоза 2 [55] ) и PPP3CC (тестис-специфическая серин / треонин-протеинфосфатаза [56]).

    Неожиданно оказалось, что альтернативный промотор PIWIL2 в экзоне 7 увеличил активность более чем в два раза только по сравнению с промотором PHYHIP (рис. 4B), но не с POLR3D и двумя контролями, что демонстрирует промотор-специфическое действие энхансеров — один об их внутренних особенностях.Примечательно, что мы также могли наблюдать, что эта энхансерная активность была сильнее в случае прямой ориентации. Фактически, о таких случаях сообщалось ранее, и их связывали с возможностью того, что один или несколько дискретных цис -регуляторных элементов внутри энхансера могут обеспечивать такую ​​ориентационную зависимость [57, 58]. Тем не менее, полагаясь на наиболее консервативное определение энхансера, который увеличивает активность промотора независимо от его ориентации, мы можем утверждать, что альтернативный промотор PIWIL2 в экзоне 7 способен функционировать как энхансер только для промотора PHYHIP .

    Мы также изучили данные полимеразы II ChIA-PET (анализ взаимодействия хроматина посредством секвенирования парных концевых меток [59]) из ENCODE [60, 61] и нашли доказательства того, что альтернативный промотор PIWIL2 в экзоне 7 и промотор PHYHIP взаимодействуют в линия клеток человека K562 (K562 Pol2 ChIA-PET Interactions Rep 1 от ENCODE / GIS-Ruan, chr8: 22086341..22087865-chr8: 22143618..22145421,2). Хотя структура TAD является относительно стабильной для разных типов клеток, стадий развития и даже организмов [62–64], специфическое взаимодействие между промотором PHYHIP и экзоном 7 PIWIL2 и, в частности, его динамика требует дальнейшего изучения в дальнейшем. эксперименты.

    Заключение

    В целом представленные здесь данные предоставляют как косвенные (модификации хроматина и эРНК), так и прямые (анализы репортерной люциферазы) доказательства, предполагающие, что геномная область вокруг экзона 7 гена PIWIL2 действует как энхансер для промотора PHYHIP . В качестве побочного продукта транскрипции эРНК этот внутригенный энхансер также продуцирует альтернативную изоформу мРНК PIWIL2 , которая, в свою очередь, транслируется в новую изоформу белка PIWIL2 [30].Важно отметить, что эта короткая изоформа PIWIL2, лишенная N-концевого домена, проявляет разные свойства и может способствовать онкогенезу в отличие от своего полноразмерного аналога ([29] и наши неопубликованные данные). Хотя необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы проанализировать детали и динамику функции канонических и альтернативных промоторов PIWIL2, насколько нам известно, это первое сообщение о транскрибировании регуляторного элемента и, соответственно, возникновении матрицы мРНК для альтернативной изоформы белка.

    С более широкой точки зрения, это открытие открывает новую форму взаимодействия между внутригенными энхансерами и экспрессией генов. Возможный сдвиг в ландшафте геномных энхансеров при заболевании может способствовать нарушению регуляции клеточных процессов за счет генерации новых изоформ белка [65, 66]. Чтобы ответить на эти вопросы, необходимы полногеномные и протеомные исследования.

    Дополнительная информация

    S1 Рис. Данные FANTOM5 / ENCODE CAGE вокруг гена PIWIL2.

    Варианты транскриптов гена

    PIWIL2 показаны зелеными горизонтальными полосами на верхней панели (соответствует аннотациям Gencode: ENST00000356766.6, ENST00000521356.1, ENST00000454009.2, ENST00000519884.1). Пики FANTOM5 CAGE изображены в виде стрелок на средней панели (зеленая смысловая цепь, пурпурная антисмысловая цепь) и сопровождаются либо номером пика (например, p1 @ PIWIL2), либо его точными геномными координатами (например, p @ chr8: 22140624–22140625). Необработанный сигнал ENCODE CAGE отображается на нижней панели в TMP (количество тегов CAGE на миллион считываний).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454.s001

    (PDF)

    S2 Рис. Данные консорциума по картированию эпигеномики NIH.

    Изучение состояния хроматина с использованием ChromHMM, основанного на многомерной скрытой марковской модели. Базовая модель с 15 состояниями (5 баллов, 127 эпигеномов), основанная на первичных данных о гене PIWIL2.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454.s002

    (PPTX)

    S3 Рис. Данные консорциума по картированию эпигеномики NIH.

    Изучение состояния хроматина с использованием ChromHMM, основанного на многомерной скрытой марковской модели. Модель с 25 состояниями (12 баллов, 127 эпигеномов), основанная на вмененных данных вокруг экзонов 1–14 гена PIWIL2.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454.s003

    (PPTX)

    S4 Рис. Сегментация хроматина на основе наборов данных ENCODE о модификациях гистонов, данных открытого хроматина и данных о специфическом связывании TF.

    Используя два разных метода неконтролируемого машинного обучения (ChromHMM и Segway), геном был автоматически сегментирован на непересекающиеся сегменты. Консенсусная унифицированная сегментация (комбинированная) также была получена путем согласования результатов отдельных сегментов.Также представлены слоистые треки модификации хроматина h4K4me1 в клеточных линиях ENCODE Tier 1 и Tier 2 (верхняя часть) и транскрипционный фактор ChIP-seq (нижняя часть).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454.s004

    (PPTX)

    S5 Рис. Канонические и альтернативные промоторные области PIWIL2, используемые в анализах репортерных векторов люциферазы.

    Просмотр в браузере генома UCSC областей промотора (отмечены красными стрелками) вместе с слоистыми треками модификаций хроматина h4K4me1, h4K27ac и h4K4me3 в клеточных линиях ENCODE Tier 1 и Tier 2 (верхняя часть), кластеры гиперчувствительности DNaseI, фактор транскрипции ChIP-seq и предполагаемые сайты связывания факторов транскрипции (средняя часть), а также необработанные сигналы ChIP-seq h4K4me1, h4K4me3, h4K27ac и h4K27me3 для линий клеток K562, HeLa-S3 и NT2D1 из ENCODE (нижняя часть, два эксперимента для линии клеток K562, проведенных на показаны разные лаборатории).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454.s005

    (PPTX)

    S6 Рис. Неполиаденилированная транскрипция между экзон-экзонными соединениями гена

    PIWIL2 в образцах рака.

    qRT-PCR использовали для оценки уровня общей РНК и ее фракции полиА + и рассчитывали отношение общей РНК к фракции полиА +. Были исследованы образцы семиномного и несеминомного рака яичка, а также прилегающие нормальные ткани яичка.

    https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0156454.s006

    (PDF)

    S7 Рис. Неполиаденилированная транскрипция между экзон-экзонными соединениями гена

    PIWIL2 в клеточных линиях.

    qRT-PCR использовали для оценки уровня общей РНК и ее фракции полиА + и рассчитывали отношение общей РНК к фракции полиА +. Были проанализированы четыре клеточные линии: TERA1 и NT2D1 –эмбриональная карцинома, TCam2 –семинома и A549 – карцинома легкого.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454.s007

    (PDF)

    S8 Фиг.Контактные домены вокруг PIWIL2 из карты Hi-C с разрешением 1 kb (Rao et al, 2014).

    Представлена ​​тепловая карта геномных контактов вдоль chr8: 21 880 000–22 470 000 (hg19). Контактные домены обозначены желтыми прямоугольниками и показаны положения генов PHYHIP , POLR3D , PIWIL2 , принадлежащих к одному и тому же контактному домену. PPP3CC и KIAA1967 также представлены в соседнем контактном домене.

    https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0156454.s008

    (PDF)

    S9 Фиг. Промоторные области PHYHIP, POLR3D, PPP3CC и KIAA1967, используемые в анализах репортерного вектора люциферазы.

    Просмотр в браузере генома UCSC областей промотора (отмечены красными стрелками) вместе с многослойными треками модификации хроматина h4K4me3 в клеточных линиях ENCODE уровня 1 и уровня 2 (активный промоторный знак, верхняя часть каждой панели) и кластеров гиперчувствительности DNaseI (нижняя часть каждой панели).

    https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0156454.s009

    (PPTX)

    Благодарности

    Мы благодарим профессора Евгения Свердлова за критическое прочтение рукописи, доктора Дмитрия Дидича за конструкт pGL4.10mP2, доктора Сергея Акопова за помощь в работе с клеточными культурами, доктора Алексея Трякина (Российский онкологический научный центр им. сбор образцов и гистологическая оценка.

    Вклад авторов

    Задумал и спроектировал эксперименты: TLA LGN IVG.Проведены эксперименты: ЯВС САК МВЗ ИВГ. Проанализированы данные: YVS SAK IVG. Написал бумагу: IVG.

    Список литературы

    1. 1. Шпиц Ф, Ферлонг Э. Факторы транскрипции: от связывания энхансера до контроля развития. Природа рассматривает генетику. 2012. 13 (9): 613–26. pmid: 22868264.
    2. 2. Бенабдалла Н.С., Бикмор В.А. Регуляторные домены и их механизмы. Колд Спринг Харб Symp Quant Biol. 2015. pmid: 265.
    3. 3. Верниммен Д., Бикмор В.А.Иерархия активации транскрипции: от энхансера к промотору. Тенденции Genet. 2015. pmid: 26599498.
    4. 4. Дэн Б., Мельник С, Повар ПР. Фабрики транскрипции, петли хроматина и нарушение регуляции экспрессии генов при злокачественных новообразованиях. Семинары по биологии рака. 2013. 23 (2): 65–71. pmid: 22285981.
    5. 5. Фейерборн А, повар PR. Почему активность гена зависит от его соседей. Тенденции Genet. 2015; 31 (9): 483–90. pmid: 26259670.
    6. 6. Матару Н., Ахитув Н.Незначительные петли в основных складках: петля энхансер-промотор, реструктуризация хроматина и их связь с регуляцией транскрипции и заболеванием. PLoS генетика. 2015; 11 (12): e1005640. pmid: 26632825.
    7. 7. Секстон Т., Яффе Э., Кенигсберг Э., Бантиньи Ф., Леблан Б., Хойчман М. и др. Принципы трехмерной складки и функциональной организации генома дрозофилы. Клетка. 2012. 148 (3): 458–72. pmid: 22265598.
    8. 8. Нора Е.П., Ладжой Б.Р., Шульц Е.Г., Джорджетти Л., Окамото И., Слуга Н. и др.Пространственное разделение регуляторного ландшафта центра X-инактивации. Природа. 2012. 485 (7398): 381–5. pmid: 22495304; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3555144.
    9. 9. Диксон Дж. Р., Селварадж С., Ю Ф, Ким А., Ли Й, Шен Й и др. Топологические домены в геномах млекопитающих, идентифицированные с помощью анализа взаимодействий хроматина. Природа. 2012. 485 (7398): 376–80. pmid: 22495300; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3356448.
    10. 10. Хоу Ц., Ли Л., Цинь З.С., Корсес В.Г. Плотность генов, транскрипция и инсуляторы способствуют разделению генома дрозофилы на физические домены.Молекулярная клетка. 2012. 48 (3): 471–84. pmid: 23041285; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3496039.
    11. 11. Orom UA, Shiekhattar R. Длинные некодирующие РНК открывают новую эру в биологии энхансеров. Клетка. 2013. 154 (6): 1190–3. pmid: 24034243; PubMed Central PMCID: PMC4108076.
    12. 12. Kim YW, Lee S, Yun J, Kim A. Хроматиновая петля и транскрипция эРНК предшествуют активации транскрипции гена в локусе бета-глобина. Biosci Rep.2015; 35 (2). pmid: 25588787; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4370096.
    13. 13. Андерссон Р., Санделин А., Данко К.Г. Единая архитектура транскрипционных регуляторных элементов. Тенденции Genet. 2015; 31 (8): 426–33. pmid: 26073855.
    14. 14. Core LJ, Мартинс А.Л., Данко К.Г., Waters CT, Siepel A, Lis JT. Анализ формирующейся РНК определяет единую архитектуру инициирующих областей на промоторах и энхансерах млекопитающих. Генетика природы. 2014; 46 (12): 1311–20. pmid: 25383968; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4254663.
    15. 15. Ким Т.К., Шихаттар Р.Архитектурные и функциональные сходства между усилителями и промоутерами. Клетка. 2015; 162 (5): 948–59. pmid: 26317464; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4556168.
    16. 16. Ковальчик М.С., Хьюз Дж. Р., Гаррик Д., Линч М. Д., Шарп Дж. А., Слоан-Стэнли Дж. А. и др. Альтернативными промоторами выступают интрагенные энхансеры. Молекулярная клетка. 2012. 45 (4): 447–58. pmid: 22264824.
    17. 17. Де Фацио С., Бартоничек Н., Ди Джакомо М., Абреу-Гуджер С., Санкар А., Фуная С. и др. Эндонуклеазная активность Mili способствует амплификации пиРНК, которая подавляет элементы LINE1.Природа. 2011. 480 (7376): 259–63. pmid: 22020280.
    18. 18. Чех B, Hannon GJ. Одна петля, чтобы управлять ими всеми: цикл пинг-понга и подавление звука, управляемое piRNA. Направления биохимических наук. 2016. pmid: 26810602.
    19. 19. Ко Дж. Т., Ли Ч. Х., Ан К. Ю., Ким Дж. К., Бэ С. С., Ким Х. Х. и др. Характеристика специфического для мозга мыши ингибитора ангиогенеза 1 (BAI1) и белка 1, ассоциированного с фитаноил-КоА-альфа-гидроксилазой, нового BAI1-связывающего белка. Brain Res Mol Brain Res. 2001. 87 (2): 223–37.pmid: 11245925.
    20. 20. Бескон М., Рахмани З. Тирозин-фосфорилированная и регулируемая киназа 1A с двойной специфичностью (DYRK1A) взаимодействует с белком 1, связанным с фитаноил-КоА альфа-гидроксилазой (PAHX-AP1), специфическим для мозга белком. Int J Biochem Cell Biol. 2005. 37 (4): 775–83. pmid: 15694837.
    21. 21. Консорциум GT. Геномика человека. Пилотный анализ экспрессии генотипа-ткани (GTEx): регуляция многотканевого гена у человека. Наука. 2015; 348 (6235): 648–60. pmid: 25954001; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4547484.
    22. 22. Меле М., Феррейра П.Г., Ревертер Ф., ДеЛука Д.С., Монлонг Дж., Саммет М. и др. Геномика человека. Человеческий транскриптом в тканях и у людей. Наука. 2015; 348 (6235): 660–5. pmid: 25954002; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4547472.
    23. 23. Фог Дж., Райт WC, Loveless JD. Отсутствие контаминации клетками HeLa в 169 клеточных линиях опухолей человека. Журнал Национального института рака. 1977; 58 (2): 209–14. pmid: 833871.
    24. 24. Эндрюс П.В., Дамджанов И., Саймон Д., Бантинг Г.С., Карлин С., Дракополи, Северная Каролина и др.Клоны плюрипотентной эмбриональной карциномы, полученные из линии клеток тератокарциномы человека Tera-2. Дифференциация in vivo и in vitro. Лабораторное исследование; журнал технических методов и патологии. 1984. 50 (2): 147–62. pmid: 6694356.
    25. 25. Giard DJ, Aaronson SA, Todaro GJ, Arnstein P, Kersey JH, Dosik H, et al. Культивирование опухолей человека in vitro: создание клеточных линий, полученных из серии солидных опухолей. Журнал Национального института рака. 1973; 51 (5): 1417–23.pmid: 4357758.
    26. 26. Мизуно Ю., Гото А., Камидоно С., Китадзава С. [Создание и характеристика новой линии клеток опухоли половых клеток яичка человека (TCam-2)]. Nihon Hinyokika Gakkai Zasshi. 1993. 84 (7): 1211–8. pmid: 8394948.
    27. 27. Гущанская Е.С., Артемов А.В., Ульянов С.В., Логачева М.Д., Пенин А.А., Котова Е.С. и др. Кластеризация CpG-островков может составлять важный детерминант трехмерной организации интерфазных хромосом. Эпигенетика: официальный журнал Общества метилирования ДНК.2014. 9 (7): 951–63. pmid: 24736527; PubMed Central PMCID: PMC4143410.
    28. 28. Орландо В. Картирование хромосомных белков in vivo с помощью иммунопреципитации сшитого формальдегидом хроматина. Направления биохимических наук. 2000. 25 (3): 99–104. pmid: 10694875.
    29. 29. Йе Й, Инь Д.Т., Чен Л., Чжоу К., Шен Р., Хе Г и др. Идентификация Piwil2-подобных (PL2L) белков, способствующих онкогенезу. PloS один. 2010; 5 (10): e13406. pmid: 20975993; PubMed Central PMCID: PMC2958115.
    30. 30. Гайнетдинов И.В., Скворцова Ю.В., Стукачева Е.А., Быченко О.С., Кондратьева С.А., Зиновьева М.В. и др. Профили экспрессии коротких изоформ PIWIL2 различаются в опухолях семенных клеток яичек различных подтипов дифференцировки. PloS один. 2014; 9 (11): e112528. pmid: 25384072; PubMed Central PMCID: PMC4226551.
    31. 31. Консорциум F, RP, Clst, Forrest AR, Kawaji H, Rehli M и др. Атлас экспрессии у млекопитающих на уровне промотора. Природа. 2014; 507 (7493): 462–70. pmid: 24670764; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4529748.
    32. 32. Эпигеномика дорожной карты C, Kundaje A, Meuleman W, Ernst J, Bilenky M, Yen A, et al. Интегративный анализ 111 эталонных эпигеномов человека. Природа. 2015; 518 (7539): 317–30. pmid: 25693563; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4530010.
    33. 33. Консорциум EP. Интегрированная энциклопедия элементов ДНК в геноме человека. Природа. 2012. 489 (7414): 57–74. pmid: 22955616; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3439153.
    34. 34. Онг CT, Corces VG. CTCF: архитектурный белок, связывающий топологию и функцию генома.Природа рассматривает генетику. 2014; 15 (4): 234–46. pmid: 24614316; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4610363.
    35. 35. Гомес-Диас Э., Корсес В.Г. Архитектурные белки: регуляторы организации трехмерного генома в судьбе клетки. Trends Cell Biol. 2014; 24 (11): 703–11. pmid: 25218583; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4254322.
    36. 36. Панне Д. Энхансома. Curr Opin Struct Biol. 2008. 18 (2): 236–42. pmid: 18206362.
    37. 37. Герштейн МБ, Кундаже А., Харихаран М., Ландт С.Г., Ян К.К., Ченг С. и др.Архитектура регулирующей сети человека, полученная из данных ENCODE. Природа. 2012. 489 (7414): 91–100. pmid: 22955619; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4154057.
    38. 38. Ван Дж., Чжуанг Дж., Айер С., Лин Х, Уитфилд Т.В., Гревен М.С. и др. Особенности последовательности и структура хроматина вокруг участков генома, связанных 119 факторами транскрипции человека. Геномные исследования. 2012. 22 (9): 1798–812. pmid: 22955990; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3431495.
    39. 39. Ван Дж., Чжуан Дж., Айер С., Линь XY, Гревен М.С., Ким Б.Х. и др.Factorbook.org: база данных на основе Wiki для данных о связывании факторов транскрипции, созданная консорциумом ENCODE. Исследование нуклеиновых кислот. 2013; 41 (Выпуск базы данных): D171–6. pmid: 23203885; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3531197.
    40. 40. Хоффман М.М., Буске О.Дж., Ван Дж., Вен З., Билмес Дж. А., Благородный WS. Неконтролируемое обнаружение паттернов в структуре хроматина человека посредством геномной сегментации. Природные методы. 2012. 9 (5): 473–6. pmid: 22426492; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3340533.
    41. 41.Хоффман М.М., Эрнст Дж., Уайлдер С.П., Кундаже А., Харрис Р.С., Либбрехт М. и др. Интегративная аннотация элементов хроматина из данных ENCODE. Исследование нуклеиновых кислот. 2013. 41 (2): 827–41. pmid: 23221638; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3553955.
    42. 42. Эрнст Дж, Келлис М. ChromHMM: автоматизация обнаружения и характеристики состояния хроматина. Природные методы. 2012. 9 (3): 215–6. pmid: 22373907; PubMed Central PMCID: PMCPMC3577932.
    43. 43. Банерджи Дж., Рускони С., Шаффнер В.Экспрессия гена бета-глобина усиливается удаленными последовательностями ДНК SV40. Клетка. 1981; 27 (2 Pt 1): 299–308. pmid: 6277502.
    44. 44. Лай Ф, Шихаттар Р. Энхансерные РНК: новые молекулы транскрипции. Текущее мнение в области генетики и развития. 2014; 25: 38–42. pmid: 24480293.
    45. 45. Планк Дж. Л., Дин А. Усиливающая функция: сведения о механизме и геноме объединены. Молекулярная клетка. 2014; 55 (1): 5–14. pmid: 24996062.
    46. 46. Левин М., Каттольо С., Тьянь Р.Зацикливание назад, чтобы шагнуть вперед: транскрипция вступает в новую эру. Клетка. 2014. 157 (1): 13–25. pmid: 24679523; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4059561.
    47. 47. Шлюева Д., Стампфель Г., Старк А. Энхансеры транскрипции: от свойств к полногеномным предсказаниям. Природа рассматривает генетику. 2014. 15 (4): 272–86. pmid: 24614317.
    48. 48. Zentner GE, Scacheri PC. Отпечаток хроматина элементов энхансера гена. Журнал биологической химии. 2012. 287 (37): 30888–96.pmid: 22952241; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3438921.
    49. 49. Ким Т.К., Хемберг М., Грей Дж. М.. Энхансерные РНК: класс длинных некодирующих РНК, синтезируемых энхансерами. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015; 7 (1): a018622. pmid: 25561718.
    50. 50. Ким Т.К., Хемберг М., Грей Дж.М., Коста А.М., Медведь Д.М., Ву Дж. И др. Широко распространенная транскрипция энхансеров, регулирующих активность нейронов. Природа. 2010. 465 (7295): 182–7. pmid: 20393465; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3020079.
    51. 51.Гайнетдинов И.В., Кондратьева С.А., Скворцова Ю.В., Зиновьева М.В., Стукачева Е.А., Климов А. Отличительные эпигенетические особенности предопухолевых тканей яичка, прилегающих к семиномам и несеминомам. Oncotarget. 2016. pmid: 26843623.
    52. 52. ван Аренсберген Дж., ван Стенсель Б., Бассемейкер Х. Дж. В поисках детерминант специфичности взаимодействия энхансер-промотор. Trends Cell Biol. 2014. 24 (11): 695–702. pmid: 25160912; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4252644.
    53. 53.Рао С.С., Хантли М.Х., Дюран Н.С., Стаменова Е.К., Бочков И.Д., Робинсон Дж. Т. и др. Трехмерная карта генома человека при разрешении килобаз раскрывает принципы образования петель хроматина. Клетка. 2014. 159 (7): 1665–80. pmid: 25497547.
    54. 54. Ким Д.Х., Саетром П., Снов О-младший, Росси Дж. Дж. МикроРНК-направленное подавление транскрипционного гена в клетках млекопитающих. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2008. 105 (42): 16230–5. pmid: 18852463; PubMed Central PMCID: PMC2571020.
    55. 55. Kim JE, Chen J, Lou Z. p30 DBC является потенциальным регулятором онкогенеза. Клеточный цикл. 2009. 8 (18): 2932–5. pmid: 19657230; PubMed Central PMCID: PMC2777512.
    56. 56. Мурамацу Т., Кинкейд Р.Л. Молекулярное клонирование и хромосомное картирование гена человека для семенников-специфической каталитической субъединицы кальмодулин-зависимой протеинфосфатазы (кальциневрин А). Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях. 1992. 188 (1): 265–71. pmid: 1339277.
    57. 57.Swamynathan SK, Piatigorsky J. Ориентационно-зависимое влияние межгенного энхансера на промоторную активность дивергентно транскрибируемых генов Shsp / альфа-B-кристаллина и Mkbp / HspB2 мыши. Журнал биологической химии. 2002. 277 (51): 49700–6. pmid: 12403771.
    58. 58. Ли С., Хирш М., Картер П., Асокан А., Чжоу Х, Ву З. и др. Небольшой регуляторный элемент из хромосомы 19 усиливает экспрессию специфичных для печени генов. Gene Ther. 2009. 16 (1): 43–51. pmid: 18701910.
    59. 59. Фулвуд М.Дж., Лю М.Х., Пан Ю.Ф., Лю Дж., Сюй Х., Мохамед Ю.Б. и др. Связанный с альфа-эстрогеновыми рецепторами хроматин человека. Природа. 2009. 462 (7269): 58–64. pmid: 198

      ; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC2774924.

    60. 60. Ли Джи, Руан Х, Ауэрбах Р.К., Сандху К.С., Чжэн М., Ван П. и др. Обширные промотор-центрированные взаимодействия хроматина обеспечивают топологическую основу регуляции транскрипции. Клетка. 2012. 148 (1-2): 84–98. pmid: 22265404; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3339270.
    61. 61. Розенблум К.Р., Слоан К.А., Маллади В.С., Дрезер Т.Р., Леннед К., Киркуп В.М. и др. КОДИРОВАТЬ данные в браузере генома UCSC: обновление за 5-й год. Исследование нуклеиновых кислот. 2013; 41 (выпуск базы данных): D56–63. pmid: 23193274; PubMed Central PMCID: PMC3531152.
    62. 62. Дости Дж., Бикмор В.А. Хромосомная организация в ядре — картирование новой территории в Hi-Cs. Текущее мнение в области генетики и развития. 2012. 22 (2): 125–31. pmid: 22265226.
    63. 63.Гибкус Дж. Х., Деккер Дж. Иерархия трехмерного генома. Молекулярная клетка. 2013. 49 (5): 773–82. pmid: 23473598; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3741673.
    64. 64. Гави-Хелм Y, Кляйн Ф.А., Пакозди Т., Сиглар Л., Нордермейр Д., Хубер В. и др. Петли энхансера кажутся стабильными во время развития и связаны с приостановленной полимеразой. Природа. 2014; 512 (7512): 96–100. pmid: 25043061.
    65. 65. Смит Э., Шилатифард А. Биология энхансеров и энхансеропатии. Структурная и молекулярная биология природы.2014. 21 (3): 210–9. pmid: 24599251.
    66. 66. Herz HM, Hu D, Shilatifard A. Неисправность энхансера при раке. Молекулярная клетка. 2014. 53 (6): 859–66. pmid: 24656127; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4049186.

    Опубликованных статей в рецензируемом журнале

    Опубликованных статей в реферируемом журнале
    Опубликованные статьи в рецензируемом журнале
    [ALM99]
    П. Обри, Д. Лазар, М. Морено Маза. К теории треугольных множеств. Журнал символических вычислений , 28 (1-2): 105-124, 1999. PDF
    [AM99]
    П. Обри и М. Морено Маза. Треугольные множества для решения полиномиальных систем: сравнительный анализ. реализация четырех методов. Журнал символических вычислений , 28 (1-2): 125-154, 1999. PDF
    [FM02]
    М.В. Фурсов и М. Морено Маза. О компьютерной классификации связанных интегрируемых уравнений. Журнал символических вычислений , 33 (1): 647-660, 2002.PDF
    [MRSW07b]
    М. Морено Маза, Г. Рид, Р. Скотт и В. Ву. О приближенных треугольных разложениях в нулевой размерности. Журнал символических вычислений , 42 (7): 693-716, 2007. PDF
    [DJMS08]
    X. Дахан, X. Джин, М. Морено Маза и Э. Шост. Изменение порядка для обычных цепей в положительной размерности. Теоретическая информатика , 392 (2008): 3765, 2007. PDF
    [CMPX07a]
    С.Чен, М. Морено Маза, В. Пан и Ю. Се. О проверке решателей полиномиальных систем. Границы компьютерных наук в Китае , Том 2, номер 1, страницы 55-66, 2008 г. PDF
    [GKMO08]
    О. Голубицкий, М. Кондратьева, М. Морено Маза и А. Овчинников. Оценка алгоритма Розенфельда-Грёбнера. Журнал символических вычислений , 43 (8): 582-610, 2008. PDF
    [LMS08]
    X. Ли, М. Морено Маза и Э. Шост.Быстрая арифметика для треугольных множеств: от теории к практике. Журнал символических вычислений , 44 (7): 891-907, 2009. PDF
    [BLM07]
    Ф. Булье, Ф. Лемер и М. Морено Маза. Вычисление наборов дифференциальных характеристик путем изменения порядка. Чтобы появиться в Журнале символических вычислений . PDF
    Морено 2009-09-07

    Связь функциональной стабильности миокарда крысы и активности перекисного окисления липидов при комбинированном развитии постинфарктного ремоделирования и сахарного диабета

    Было проведено сопоставление функциональной стабильности миокарда крысы и активности процессов перекисного окисления липидов при комбинированном развитии постинфарктного ремоделирования и сахарного диабета. изучал.Функциональную стабильность миокарда изучали с помощью анализа инотропной реакции на экстрасистолический раздражитель, степени гипертрофии левого желудочка и размера зоны рубца. Показано, что при сочетанном развитии постинфарктного ремоделирования сердца (ПИКР) с сахарным диабетом (СД) масса тела животных снижалась в меньшей степени, чем у диабетических крыс. У животных с сочетанной патологией гипертрофии сердца не было. Амплитуда экстрасистолических сокращений у крыс с ПИКР в сочетании с СД не имела различий по сравнению с контрольной группой.В миокарде крыс с PICR в сочетании с DM наблюдалась постекстрасистолическая потенциация в отличие от крыс с PICR только. У крыс с сочетанной патологией снижено содержание ТВА-активных продуктов. Таким образом, результаты исследования показали, что индукция СД на этапе развития постинфарктного ремоделирования увеличивает адаптационные способности миокарда. Это проявляется в торможении повышения активности процессов ПОЛ и поддержании силовых интервальных реакций миокарда, связанных с кальциевыми транспортными системами саркоплазматического ретикулума кардиомиоцитов.

    1. Введение

    Сахарный диабет (СД) — один из угрожающих факторов, повышающих риск сердечно-сосудистых заболеваний при сердечно-сосудистых заболеваниях [1]. Метаболические изменения, развивающиеся при сахарном диабете, усугубляют нарушения функционального состояния кардиомиоцитов при сердечной недостаточности (СН) [2–4]. Во многом это вызвано изменением энергетического обмена, что является дополнительным триггером функциональных и структурных нарушений сердечной мышцы. В свою очередь, ремоделирование мембран кардиомиоцитов конечными продуктами гликирования и свободнорадикальным окислением является важным фактором развития сахарного диабета [5, 6].Все эти факторы способствуют нарушению электрической стабильности мембран и ионного баланса клеток сердца. Эти изменения могут определять в основном сократимость кардиомиоцитов. Ключевой структурой, отвечающей на внутриклеточный транспорт Са 2+ и, соответственно, на инотропный ответ кардиомиоцитов, является саркоплазматический ретикулум (SR) [7]. Было показано, что нарушение функций СР сопровождается инверсией частотно-силовых и силовых зависимостей миокарда [8, 9].Выявлена ​​взаимосвязь между изменением гомеостаза Са 2+ в кардиомиоцитах и ​​прогрессированием HF: нарушение внутриклеточного транспорта Са 2+ предшествует угнетению механической работы сердца [10–12].

    Важную роль в нарушении ионно-транспортных систем кардиомиоцитов играют процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) [13]. Усиление ПОЛ — это неспецифическая реакция клетки на патологические воздействия. Развитие СН и СД сопровождается значительным повышением активности ПОЛ [14, 15].Таким образом, показано, что продукты ПОЛ действуют на липидную фазу мембран, делая ее проницаемой для ионов водорода и кальция. Это приводит к разъединению окислительного фосфорилирования в митохондриях, что оставляет клетку в состоянии дефицита энергии. В этом состоянии избыточное количество Са 2+ , попадая в цитоплазму, не может быть выведено из миоплазмы и, как следствие, повреждает клеточные структуры.

    В отличие от клинических данных, однозначно указывающих на снижение устойчивости диабетического сердца к ишемии, результаты экспериментальных исследований достаточно противоречивы.Так, в ряде исследований отмечается парадоксально высокая устойчивость миокарда к ишемии (in vivo и in vitro) у взрослых животных с кратковременным стрептозотоцин-индуцированным диабетом [16–18]. Наше предварительное исследование также выявило факты сохранения сократимости миокарда при сочетанном развитии СН и СД. Механизмы этого явления остаются предметом научных исследований. Состояние транспортных систем Са 2+ СР кардиомиоцитов и активность процессов ПОЛ при сочетанном развитии СН и СД изучены недостаточно.

    2. Материалы и методы

    Исследование выполнено на взрослых крысах-самцах линии Вистар массой 200–220 г. Были сформированы четыре группы животных: первая группа — интактные крысы (), вторая группа — крысы с постинфарктным ремоделированием сердца (PICR) (), третья группа — крысы с индуцированным СД () и IV группа — крысы с СД, индуцированный через 2 недели после коронарной окклюзии (). К моменту эксперимента все животные были одного возраста. Инфаркт миокарда был вызван окклюзией левой передней нисходящей артерии [19]; затем животных поместили в стандартные условия вивария.Сахарный диабет вызывали однократной инъекцией стрептозотоцина («Sigma», США) в дозе 60 мг / кг абдоминально, разведенного ex tempore цитратным буфером 0,01 М / л (pН 4,5). Крысы IV группы были взяты в эксперимент через 6 недель после индукции диабета. Концентрацию глюкозы в сыворотке крови определяли с помощью ферментно-колориметрического теста («Biocon Diagnostic», Германия).

    Развитие гипертрофии сердца и левого желудочка оценивали по соответствующему соотношению масс [20]. По этой причине были определены отношения массы сердца к массе тела животного и массы левого желудочка к массе сердца.Размер постинфарктных рубцов сердца животных оценивали методом планиметрии и рассчитывали в процентах от площади свободной стенки левого желудочка [21].

    В день эксперимента отбирали кровь животных в пробирку с гепарином (10: 1). Образцы крови центрифугировали при 3000 об / мин в течение 10 мин. Полученная сыворотка распределялась по аликвотам и хранилась в жидком азоте до момента исследования.

    Изучена сократительная активность папиллярных мышц. Для этого животных под наркозом Рауша иммобилизовали со смещением шейного отдела позвоночника, а затем вскрывали грудную клетку.Изолированное сердце промывали в специализированной проточной камере через аорту раствором Кребса-Хенселейта следующего состава (в мМ): NaCl: 120; KCl: 4,8; CaCl 2 : 2,0; MgSO 4 : 1,2; KH 2 PO 4 : 1,2; NaHCO 3 : 20,0; глюкоза: 10,0 («Sigma», США). Затем сосочковые мышцы были изолированы и помещены в термостабилизированную (36 ° С) проточную камеру. Перфузия мышц производилась раствором Кребса-Хенселейта. Окисление раствора проводили карбогеном (О 2 : 95%, СО 2 : 5%).Сократительную активность мышц оценивали в изометрическом режиме с помощью преобразователя Force transducer KG-Series (Scientific Instruments GmbH, Германия). Рассчитывали напряжение, развиваемое мышцей, в расчете на диаметр изолированной мышцы (мН / мм 2 ). Стимуляцию мышц проводили электрическими импульсами прямоугольной формы длительностью 5 мс и частотой 0,5 Гц. Перед началом исследования мышцы были адаптированы к условиям перфузии и изометрическому режиму за 60 минут.

    Известно, что функциональное состояние изолированных полосок миокарда можно оценить, изменив режим их электростимуляции. При экстрасистолическом воздействии регистрировали экстрасистолическое сокращение, которое характеризует возбудимость сарколеммы [22], и постекстрасистолическое сокращение, которое отражает способность саркоплазматического ретикулума кардиомиоцитов (СР) накапливать ионы Са 2+ , которые дополнительно попадают в миоплазму при необычайном возбуждении и определяют амплитуду постекстрасистолические схватки [22].В нашей работе экстрасистолическое воздействие оказывалось дополнительным одиночным электрическим импульсом на 0,2, 0,225, 0,25, 0,5, 0,75, 1,0 и 1,5 с (экстрасистолический интервал) от начала регулярного цикла. Амплитуды экстрасистолического (ES) и постекстрасистолического (PES) сокращения выражались в процентах от амплитуды обычного (основного) цикла. Мы проанализировали зависимость изменения амплитуды сокращений ЭС и ПЭС от длительности экстрасистолического интервала.

    Активность ПОЛ в сыворотке крови оценивалась путем измерения концентрации ТБА-активных продуктов (ТВААР), полученных в результате реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТВА) [23].Концентрацию первичных продуктов конъюгатов ПОЛ-диен (ДК) измеряли в гексановых экстрактах образцов сыворотки на спектрофотометре при 232 нм [24].

    Данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха (Мe (Q1; Q3)). Для нормального распределения значений использовался критерий Стьюдента. Данные исследования представлены в виде M ± SD, где M — среднее значение, а SD — стандартное отклонение. Достоверность различий полученных данных оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни для независимых выборок в случае распределения, отличного от нормального.Различия в стоимости считались статистически значимыми.

    3. Результаты и обсуждение

    Результаты, отражающие значения показателей массы, полученные в рассматриваемых группах, представлены в таблице 1. Видно, что у животных с ПИКР (II группа) уменьшилась (на 18,8%) масса тела и увеличилась гипертрофия. (на 90%) сердце по сравнению с интактными животными. Индукция диабета (III группа) привела к снижению массы тела животных на 56%, но без гипертрофии сердца.При совместном развитии ПИКР с СД (IV группа) масса тела животных была на 26% меньше, чем у животных I группы. У этих животных, как и у животных III группы, гипертрофии сердца не было. Оказалось, что размер зоны рубца во II и IV группах не различается. Уровень глюкозы в крови животных III и IV групп превышал таковой у интактных крыс в 4,5 и 3 раза соответственно.

    98 — + DM

    Номер Группа Масса тела, г Глюкоза, моль / л Масса сердца / масса тела,
    мг / г
    Масса левого желудочка / масса сердца, мг / мг Площадь рубца,%

    I Контроль 12 298 ± 23.7 6 ± 0,37 3,29 ± 0,21 0,645 ± 0,013
    II PICR 11 242 ± 11,17 7 ± 0,13 1675093 7 ± 0,13 9169 9169 9169 9169 9169 9169 0,687 ± 0,016 51,3 ± 8,9
    III DM 8 160 ± 14,8 27 ± 2,75 3,77 ± 0,31 0,676 ± 0,014 8 221 ± 4.51 18 ± 1,79 3,37 ± 0,11 0,673 ± 0,019 46,1 ± 2,7

    Примечание . PICR: крысы с постинфарктным ремоделированием сердца. , по сравнению с контролем, по сравнению с PICR. Площадь рубца рассчитывалась как процент от площади свободной стенки левого желудочка.

    В нашем исследовании ремоделирование миокарда как после окклюзии коронарной артерии (II группа), так и после развития гипергликемии (III группа) приводило к изменению инотропной реакции папиллярных мышц на экстрасистолические воздействия по сравнению с контролем. группа (рисунок 1).Так, амплитуда сокращений ЭС сосочковых мышц крыс PICR (II группа) на коротких экстрасистолических интервалах была на 8% выше, чем у интактных животных (). После самого длинного интервала ES эта разница увеличилась и достигла 16% (). Увеличение амплитуды сокращений ЭС сосочковых мышц PICR свидетельствует об увеличении внутриклеточного количества Са 2+ , участвующего в сокращении ЭС. Известно, что ишемическое поражение сердца характеризуется подавлением АТФ-чувствительных процессов, в том числе работы внутриклеточных систем ионного транспорта.Это приводит к увеличению внутриклеточных концентраций Na + и Са 2+ [25–27]. ЭС сокращения сосочковых мышц крыс III группы имеют свои особенности. Итак, самостоятельное сокращение ЭС возникало уже на интервале ЭС 0,225 с. В остальных группах сокращение ЭС появлялось только на интервале ЭС 0,25 с. Известно, что действие ЭС вызывает инотропный ответ только в том случае, если оно происходит в фазе относительной рефракции [22]. С этих позиций результат, полученный в III группе, показывает, что развитие диабета приводит к сокращению фазы абсолютной рефракции и, следовательно, к повышенной возбудимости кардиомиоцитов.Об этом свидетельствует тот факт, что амплитуда сокращений ЭС в III группе на коротких экстрасистолических интервалах была на 20% выше, чем в I группе (интактные животные). При длительных интервалах эти различия уменьшались до 7% (Рисунок 1).


    Результат, полученный при изучении IV группы, отличается от случая II или III группы. При сочетанном развитии ишемического и диабетического поражения миокарда мы получали существенно менее выраженное изменение динамики сокращения ЭС.

    Известно, что стимулирующий импульс, приходящийся на 3-ю фазу потенциала действия, не может вызвать сократительную реакцию. Однако он инициирует дополнительный поступление внешних ионов кальция в миоплазму. Этот Са 2+ накапливается в СР и участвует в первом цикле сокращения-релаксации ППЭ [22]. По этой причине амплитуда сокращения ПЭС превышает амплитуду обычного цикла. В нашем исследовании экстраординарный импульс с интервалом ЭС 0,2 с не вызывал ЭС сокращения миокарда интактных крыс (I группа).Но мы зарегистрировали увеличение амплитуды сокращения ПЭС на 39% по сравнению с амплитудой обычного сокращения (рис. 2). С появлением сокращения ЭС и увеличением его амплитуды наблюдалось уменьшение амплитуды сокращения ЭС. У интактных животных PES-потенцирование сокращения отсутствовало на самых длинных интервалах ES (рис. 2).


    Как видно из рисунка 2, у крыс II группы ППЭ потенциации сокращения сосочковых мышц не наблюдалось независимо от продолжительности интервала ЭС.Этот факт может свидетельствовать о существенном снижении запасающей функции Са 2+ СР. Вероятно, в условиях постинфарктного ремоделирования миокарда крысы нарушается функция транспортных систем Са 2+ СР [11, 28, 29]. При исследовании папиллярных мышц крыс III группы потенциация сокращения ПЭС была существенно ниже, чем в I группе (интактные животные), и составила 21–16% (рис. 2). При комбинированном постинфарктном и диабетическом ремоделировании миокарда (IV группа) на коротких интервалах ES увеличение сокращения ПЭС составило 27–19% (рис. 2).Этот результат свидетельствует о сохранении способности SR накапливать Са 2+ .

    Известно, что повышенная активность процесса перекисного окисления является важным компонентом повреждения кардиомиоцитов инфарктом миокарда [30]. Изменение липидного бислоя мембран кислородными радикалами считается одним из механизмов нарушения внутриклеточного гомеостаза Са 2+ и сократительной активности кардиомиоцитов. Ранее мы показали, что более высокая активность ПОЛ также сохраняется во время постинфарктного ремоделирования сердца.Более того, при моделировании PICR динамика изменений ПОЛ, продуктов (TBAAP и DC) в ткани миокарда и сыворотке крови крыс совпадала [31]. На основании этого можно определить концентрацию TBAAP и DC в сыворотке крови и экстраполировать ее на миокард.

    Известно, что активация свободнорадикального окисления липидов отмечается и при СД [15]. Данные, полученные при определении концентрации TBAAP и DC в сыворотке крови животных, включенных в настоящее исследование, представлены на рисунке 3.Видно, что кровь животных PICR (II группа) содержала достоверно больше продуктов ПОЛ, чем группа интактных животных. Моделирование СД (III группа) также способствовало достоверному увеличению концентрации ТБААП и ДК. Повышенная генерация активных форм кислорода и активация процессов ПОЛ при следующих патологиях — известный факт и отмечается в работах многих авторов [13–15]. Активные формы кислорода в патологически высоких концентрациях вступают в реакцию и повреждают как липиды, так и белки клеточных мембран и компоненты сыворотки крови.В литературе есть данные о снижении активности белков и ферментов, в том числе Са 2+ -АТФазы кардиомиоцитов [13], при патологиях, сопровождающих активацию свободнорадикальных процессов. Эти результаты вполне согласуются с данными, полученными при оценке инотропной реакции сосочковых мышц животных II и III групп на экстрасистолическое действие. Эта реакция может быть следствием снижения активности Са 2+ -АТФазы и сократительных белков в результате структурных повреждений, вызванных активными формами кислорода, нарушения липидного бислоя мембраны и утечки Са 2+ из саркоплазматический ретикулум.

    Теоретически сочетание развития PICR и DM должно вызывать более выраженную активацию LPO. Однако для животных с сочетанной патологией (IV группа) мы получили парадоксальный результат. Таким образом, значение TBAAP оказалось достоверно ниже, чем во II группе. Также имеет место тенденция к снижению концентрации DC. Полученные данные хорошо согласуются с результатами, характеризующими сократительную способность сосочковых мышц животных IV группы. Снижение концентрации ТБААП свидетельствует о снижении интенсивности прохождения завершающих стадий реакции перекисного окисления липидов.Факт незначительного снижения ДК свидетельствует о том, что интенсивность первых стадий ПОЛ остается на достаточно высоком уровне. Образующиеся на этих стадиях метаболиты жирных кислот могут принимать участие в образовании других продуктов ПОЛ [32].

    Наши данные свидетельствуют о том, что индукция диабета на фоне постинфарктного ремоделирования парадоксальным образом способствует поддержанию функциональной активности транспортных систем Са 2+ СР. Это может быть связано с тем, что продукты гликозилирования увеличивают жесткость мембран кардиомиоцитов на фоне развивающейся гипергликемии.Усиление адаптивных реакций при сочетанном развитии постинфарктного и диабетического поражения миокарда может быть связано с особенностями внутриклеточного энергетического обмена при данных патологических состояниях. Итак, повышение уровня глюкозы на первых этапах развития постинфарктного кардиосклероза позволяет активировать процессы гликолиза в кардиомиоцитах. Известно, что положительное влияние глюкозы на работу сердца при экспериментальной ишемии миокарда связано с увеличением гликолитической продукции АТФ [33, 34].Сдвиг энергетического обмена в сторону гликолитической продукции АТФ в сочетании с ингибированием активности ПОЛ может способствовать достижению более высокой функциональной активности транспортной системы Са 2+ СР при сочетанной патологии. Полученные нами данные соответствуют результатам других исследователей. Так, было показано, что АТФ, образующийся в процессе гликолиза, является незаменимым источником энергии для транспортной системы Са 2+ СР [35]. Повышение ишемической резистентности миокарда описано у животных с кратковременным стрептозотоцином-стимулированным диабетом in vivo и in vitro [16, 36].

    Таким образом, результаты настоящего исследования показали, что в условиях эксперимента индукция СД на этапе формирования постинфарктного ремоделирования увеличивает адаптационные способности миокарда. Это проявляется в торможении повышения активности процессов ПОЛ и поддержании силовых интервальных реакций миокарда, связанных с кальциевыми транспортными системами кардиомиоцитов СР.

    Следующая запись

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *