Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Регуляция экспрессии генов — это многослойный процесс, который включает такие аспекты, как промоторы, энхансеры, факторы транскрипции, модификации хроматина и пространственная организация ядра. Все эти составляющие взаимодействуют посредством перекрестных помех, и их сложное взаимодействие приводит к различным паттернам экспрессии в ряде тканей и типов клеток [1–3]. Тем не менее, недавние успехи в исследованиях регуляции транскрипции выявили общие черты, характерные для сайтов активной экспрессии генов: совместная локализация транскрибируемых генов на фабриках транскрипции [4, 5], взаимодействие нескольких энхансеров с несколькими промоторами внутри топологически ассоциирующих доменов (TAD) [6] , аналогичные модификации хроматина внутри TAD [7–10], транскрипция инициируется на энхансерах (энхансерная РНК, эРНК) [11, 12].Другое новое понимание — это общая архитектура промоторов и энхансеров как платформ для инициации транскрипции, ведущая к относительно стабильной кодирующей белок мРНК и временной эРНК, соответственно [13-15]. Эти данные указывают на тот факт, что энхансеры потенциально могут действовать как промоторы и наоборот, при правильной клеточной среде. Среди таких ранее описанных случаев — энхансеры мышиного альфа-глобинового локуса, расположенные в интронах гена Nprl3 , которые действуют как альтернативные промоторы для этого гена, давая начало новым продуктам мРНК [16].Однако альтернативных белковых продуктов в этом случае не обнаружено. Дальнейший полногеномный анализ транскриптома показал, что до 50% внутригенных энхансеров инициируют транскрипцию эРНК и почти 10% продуцируют альтернативные варианты мРНК для соответствующих генов в эритроидных клетках мышей [16]. Кроме того, от 1% до 7,5% активных сайтов начала транскрипции (TSS) имеют очевидные модификации хроматина энхансера в линиях клеток человека [16].

В этой работе мы сообщаем набор как косвенных, так и прямых доказательств, демонстрирующих аналогичную настройку для человеческого семенникового гена PIWIL2 , который является центральным участником пути piRNA / PIWI, ответственного за эпигенетическое молчание ретротранспозонов [17, 18].В частности, описанный ранее альтернативный промотор PIWIL2 в экзоне 7, по-видимому, способен действовать как энхансер для гена PHYHIP , расположенного на 60 т.п.н. Хотя PHYHIP высоко экспрессируется в тканях мозга [19] и, как предполагается, играет роль в развитии неврологических аномалий, наблюдаемых у пациентов с синдромом Дауна [20], он также коэкспрессируется с PIWIL2 в тканях семенников [21]. , 22]. Взятые вместе, это наблюдение подразумевает, что переключение между функциями энхансера и промотора может влиять как на экспрессию мРНК, так и на экспрессию белков некоторых генов.

Методы и материалы

Заявление об этике

Семь пар образцов опухолей семенных клеток яичка и соответствующие прилегающие нормальные паренхимы яичка были получены из образцов орхиэктомии. Образцы немедленно замораживали в жидком азоте. Все пациенты предоставили письменное информированное согласие в соответствии с федеральным законом, и исследование было одобрено этическими комитетами Института биоорганической химии им. Шемякина-Овчинникова РАН и РОНЦ им. Блохина после рассмотрения форм согласия и информации пациентов. .

Клеточные линии

Клеточные линии, использованные в экспериментах, включали TERA1 (ATCC HTB-105, эмбриональная карцинома яичка [23]), NT2 / D1 (ATCC CRL-1973, плюрипотентная эмбриональная карцинома яичка [24]) и A549 (ATCC CCL-185, карцинома легкого [ 25]). Культуры клеток приобретали в ATCC (США) и выращивали в среде DMEM / F12 (1: 1) (Invitrogen, США) с добавлением 10% FCS (Invitrogen, США). Клеточная линия TCam-2 [26] была любезно предоставлена ​​профессором доктором Хюбертом Шорле (отделение патологии развития, Институт патологии, Боннская медицинская школа, Германия).Клетки TCam-2 культивировали в среде RPMI 1640 (Invitrogen, США) с добавлением 10% FCS (Invitrogen, США).

Иммунопреципитация хроматина

ChIP выполняли, как описано ранее [27, 28], с использованием антител к модификациям гистонов человека, перечисленных в таблице S1. ДНК очищали с помощью набора для очистки QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, США). КПЦР проводили с использованием системы qPCRmix-HS SYBR (Евроген, Россия) на Lightcycler 480 (Roche, США) в соответствии с инструкциями производителей. Фрагменты ДНК амплифицировали в течение 40 циклов: 95 ° C в течение 20 с, 60 ° C в течение 20 с, 72 ° C в течение 20 с.Относительный уровень модификации хроматина определяли количественно, используя «входной контроль» в качестве эталона. Биологические и технические дубликаты были использованы для обеспечения воспроизводимости. Пары праймеров, использованные при амплификации, перечислены в таблице S2.

qRT-PCR

Экстракцию и очистку тотальной РНК из клеточных линий, TGCT и нормальных образцов семенников проводили с помощью Trizol (Thermo Scientific, США) в соответствии с инструкциями производителя. Синтез первой цепи кДНК проводили с использованием либо случайного гексануклеотида (Promega, США), либо праймера олиго-dT (5’-dT ₂₀ V-3 ’) и транскриптазы MintReverse (Евроген, Россия) согласно протоколам производителей.Реакции qRT-PCR проводили с использованием системы qPCRmix-HS SYBR (Евроген, Россия) на Lightcycler 480 (Roche, США) в соответствии с инструкциями производителей. Фрагменты ДНК амплифицировали в течение 40 циклов: 95 ° C в течение 20 с, 60 ° C в течение 20 с, 72 ° C в течение 20 с. Относительный уровень мРНК количественно определяли с использованием мРНК бета-актина (ген ACTB ) в качестве эталона. Технические трижды использовались для обеспечения воспроизводимости. Пары праймеров, используемые при амплификации, перечислены в таблице S3.

Люциферазные репортерные векторы, трансфекция и анализ репортерного гена

экстрагировали из одного из нормальных образцов семенников с помощью набора для очистки геномной ДНК Wizard (Promega, США).Геномные области были амплифицированы с использованием праймеров, перечисленных в таблице S4. Продукты ПЦР лигировали в pGL4.10 [luc2], pGL4.13 [luc2 / SV40] или pGL4.10mP2 (файл S1) с ДНК-лигазой Т4 (Thermo Scientific, США): в качестве промоторов — между сайтами NheI и BglII, в качестве энхансеров. –В любой ориентации на сайте NotI. Перед трансфекцией конструкции линеаризовали рестрикционными ферментами PvuI или SalI для прямой и обратной ориентации соответственно. Контроли «без энхансера» также были линеаризованы с помощью тех же рестрикционных ферментов.Трансфекцию проводили с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Клетки лизировали через 24 часа после трансфекции, и активность люцифераз светлячка и Renilla reniformis оценивали с использованием системы DualLuciferase Reporter Assay System (Promega, США) и люминометра Tecan GENios Pro (MTX Lab Systems, США) в соответствии с протоколами производителей. . Биологические и технические дубликаты были использованы для обеспечения воспроизводимости.

Результаты и обсуждение

PIWIL2 — это тестикоспецифический белок, участвующий в пути piRNA, который регулирует экспрессию ретротранспозонов в сперматогенезе [17].Ye et al. ранее сообщали об альтернативных промоторах гена PIWIL2 , которые они идентифицировали компьютерным путем [29]. Наша группа также картировала альтернативные сайты начала транскрипции в PIWIL2, экзонах 5 и 7 в линиях клеток рака яичка TERA1 и NT2D1, используя традиционные подходы молекулярной биологии [30].

Важно отметить, что альтернативные промоторы в экзонах 5 и 7 были также идентифицированы консорциумом FANTOM5 в тканях, не являющихся тестикулярными, в их экспериментах CAGE (S1 Fig) [31].Кроме того, при анализе треков состояния хроматина на основе 127 образцов в Roadmap Epigenomics Project [32] были обнаружены дополнительные доказательства: область около PIWIL2 экзон 7 содержит эпигенетические метки промотора в 10 первичных и 4 вмененных наборах данных (S2 и S3, рис. соответственно). В целом, эти результаты обеспечивают дополнительную поддержку наших открытий PIWIL2 альтернативных промоторов в линиях клеток рака яичка.

Однако более тщательное изучение данных проекта Roadmap Epigenomics показало, что между 6 и 28 первичными наборами данных (S2 рис.) И между 44 и 55 вмененными наборами данных (S3 рис.) Отображены комбинации эпигенетических меток около PIWIL2 экзонов 1 5 и 7, характерные для энхансеров.Более того, данные ENCODE также предполагают, что альтернативных промоторов PIWIL2 как в экзонах 5, так и в 7 могут функционировать как энхансеры [33]. В частности, пики h4K4me1 были обнаружены в наборах данных ENCODE для клеточных линий уровня 1 и 2 (рис. S4 и S5). Кроме того, сайты связывания для белков, обычно связанных с энхансерами, такими как CTCF [34, 35] и P300 [36], также расположены рядом с альтернативными промоторами в экзонах 5 и 7 (S4 Fig) [37-39]. Кроме того, существует ряд предполагаемых мотивов связывания факторов транскрипции вокруг этих промоторов (S5 фиг.) И значительное количество как тканеспецифичных, так и повсеместно экспрессируемых факторов транскрипции, связанных в различных клеточных линиях, согласно экспериментам ENCODE ChIP-seq (S5 фиг.).

Мы дополнительно изучили треки данных сегментации генома ENCODE, которые были сгенерированы для 6 клеточных линий с использованием различных методов (S4 Fig, [40–43]): по крайней мере, один метод назначил область вокруг промотора в экзоне 7 в качестве энхансера для всех 6 клеточных линий. и для 2 клеточных линий в случае промоторов в экзонах 1 и 5 соответственно (S4 фиг.).

В целом, имеется значительное количество доказательств, позволяющих предположить, что промоторы PIWIL2 в экзонах 5 и 7 также могут функционировать как энхансеры.Чтобы проверить, так ли это в тканях и клеточных линиях семенников, мы рассмотрели три свойства энхансеров: продукцию эРНК (связанную с некоторыми энхансерами), специфические модификации хроматина и способность увеличивать активность промотора независимо от ориентации [43–47] .

Модификации хроматина вокруг

Исследования полного генома приписывают определенные модификации хроматина энхансерным элементам: h4K4me1 / h4K27ac для активных энхансеров и h4K4me1 / h4K27me3 для сбалансированных / неактивных энхансеров, в отличие от h4K4me3 для промоторов [48].Чтобы увидеть, присутствуют ли эти особенности в каноническом промоторе PIWIL2 в экзоне 1 и альтернативных промоторах в экзонах 5 и 7, мы провели эксперименты ChIP с антителами к этим модификациям на трех клеточных линиях, связанных с раком яичка (TCam-2 — производное семиномы, TERA1 и NT2D1 –эмбриональная карцинома) и одна клеточная линия карциномы легкого (A549). Промотор GAPDH (ген домашнего хозяйства) использовали в качестве положительного контроля, а интрон 8 PIWIL2 , а также межгенный локус на хромосоме 1 — в качестве отрицательного контроля.

Интересно, что хотя канонический промотор PIWIL2 в экзоне 1 содержит модификации гистонов, характерные как для промоторов (h4K4me3), так и для энхансеров (h4K4me1) во всех протестированных клеточных линиях, он, вероятно, будет неактивен из-за присутствия молчащей метки h4K27me3 ( Рисунок 1). Отсутствие промоторной активности в экзоне 1 также подтверждается предыдущими открытиями, показывающими, что PIWIL2 экспрессируется в виде его N-усеченных изоформ белка в большинстве клеточных линий и раковых тканей [29, 30].

Рис. 1. Модификации хроматина вокруг канонических и альтернативных промоторов PIWIL2 .

Относительный уровень h4K4me1 (гистон 3 лизин 4 монометилированный, энхансерная метка), h4K4me3 (гистон 3 лизин 4 триметилированный, активный промоторный знак), h4K27ac (гистон 3 лизин 27 ацетилированный, метка активного регуляторного элемента) и h4K27me3 (гистон 3 лизин 27 триметилированные, факультативные метки гетерохроматина) модификации гистонов, оцененные с помощью ChIP-PCR с двумя наборами пар праймеров вокруг канонического промотора PIWIL2 в экзоне 1 и альтернативных промоторов в экзонах 5 и 7.Результаты показаны для четырех клеточных линий: TERA1 и NT2D1 –эмбриональная карцинома, TCam2 –семинома и A549 – карцинома легкого. Отрицательные контроли — это интрон 8 PIWIL2, и межгенный локус на хромосоме 1, положительный контроль — промотор GAPDH . Сводная информация о P-значении непарного U-критерия Манна-Уитни представлена ​​для некоторых пиков (ns — несущественно, * — p-значение <0,05, ** - p-значение <0,01).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454.g001

Кроме того, в отличие от области генома вокруг экзона 5, альтернативный промотор в экзоне 7 демонстрирует статистически значимое обогащение метки h4K4me1 по сравнению с отрицательными контролями во всех случаях. линии клеток, кроме TCam-2 (рис. 1).Более того, уровень меток h4K27ac вокруг экзона 7 также выше, чем в отрицательном контроле (рис. 1), что позволяет предположить, что он может быть активно функционирующим энхансером, по крайней мере, в клеточных линиях TERA1, NT2D1 и A549.

Недавно было обнаружено, что некоторые энхансеры транскрибируются с помощью Pol II и продуцируют эРНК (энхансерная РНК), которые представляют собой либо полиаденилированные, либо неполиаденилированные короткие транскрипты (как сплайсированные, так и не сплайсированные), возникающие вокруг энхансеров в одном или двух направлениях [49].В одном из первых исследований, сообщающих о продукции неполиаденилированной эРНК, эти транскрипты, связанные с энхансером, были идентифицированы путем анализа общей РНК [50]. Поэтому мы попытались использовать аналогичный подход и оценили наличие неполиаденилированной транскрипции около альтернативных промоторов PIWIL2 с помощью qRT-PCR на общей РНК и сравнили ее с результатами для ее фракции polyA +. Мы разработали 15 пар праймеров, равномерно покрывающих всю длину гена PIWIL2 и специфически нацеленных на соединения экзон-экзон, чтобы минимизировать вклад возможной остаточной геномной ДНК в образцах.Результаты нормализовали по эффективности каждой пары праймеров и рассчитывали отношение общей РНК к фракции полиА +. Таким образом, мы установили профиль транскрипции вдоль гена и вклад неполиаденилированных транскриптов в каждой точке гена PIWIL2 .

Результаты для 7 нормальных / опухолевых пар образцов рака яичка (как семиноматозных, так и несеминоматозных) довольно неоднородны (рис. 2 и рис. S6), что согласуется с ранее опубликованными данными, показывающими, что как нормальные ткани яичка, так и рак яичка имеют значительную вариабельность среди людей [51].Однако данные ясно демонстрируют, что все образцы опухолей и некоторые прилегающие нормальные ткани семенников имеют заметные и статистически значимые пики для некоторых соединений экзонов, особенно 4–5 и 8–9 (рис. 2 и S6, рис.). Менее выраженная, но аналогичная картина наблюдалась для клеточных линий TERA1, NT2D1 и A549 (S7 фиг.). Это открытие, по-видимому, указывает на присутствие значительной фракции неполиаденилированных транскриптов вокруг экзонов 5 и 7, которые могут быть транскриптами эРНК.

Рис 2.Неполиаденилированная транскрипция между экзон-экзонными соединениями гена PIWIL2 .

qRT-PCR использовали для оценки уровня общей РНК и ее фракции полиА + и рассчитывали отношение общей РНК к фракции полиА +. Были исследованы образцы семиномного и несеминомного рака яичка, а также прилегающие нормальные ткани яичка. Сводная информация о P-значении непарного U-критерия Манна-Уитни представлена ​​для 4–5 и 8–9 пиков экзон-экзонных соединений (нс — незначимо, *** — p-значение <0,001).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0156454.g002

Анализы репортера люциферазы демонстрируют, что альтернативный промотор

Хотя модификации хроматина и продукция эРНК рассматриваются как косвенные доказательства, существенным свойством энхансера является повышение активности промотора в зависимости от типа клетки [47]. Чтобы проверить, могут ли канонические и альтернативные промоторы PIWIL2 действовать в качестве энхансеров, мы клонировали их в обеих ориентациях в репортерные векторы люциферазы ниже гена luc , управляемого промотором SV40 или CMV (рис. ) и эквимолярные количества конструкций зондировали в двух клеточных линиях (TERA1 и NT2D1).Важно отметить, что ранее было показано, что участки генома, которые мы тестировали на свойства энхансеров, также обладают промоторной активностью. Поэтому, чтобы различать свойства промотора и энхансера, мы линеаризовали репортерные векторы люциферазы, разрезая их ниже (прямая ориентация) или выше (обратная ориентация) сайта, в который мы поместили исследуемые энхансеры-кандидаты (рис. 3). Важно отметить, что после линеаризации энхансер-кандидат будет располагаться либо ниже (прямая ориентация), либо выше (обратная ориентация) репортерного гена люциферазы с промотором (рис. 3).Это позволяет нам проверить другой аспект функции энхансера: способность увеличивать активность промотора независимо от его положения (выше или ниже по течению).

Рис. 3. Структура репортерных векторов люциферазы, используемых в анализах. Плазмиду

pGL4.10 использовали для конструирования векторов с экспрессией гена luc , управляемой различными промоторами (верхняя часть в скобках) и кандидатным энхансером в любой ориентации (нижняя часть). Поскольку кандидаты в энхансеры также обладают промоторной активностью, чтобы различить их, векторы были линеаризованы путем разрезания участков, показанных красными стрелками.Обратите внимание, что после такой линеаризации энхансер-кандидат будет располагаться либо выше (обратная ориентация), либо ниже (прямая ориентация) гена luc и его промотора.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454.g003

Интересно, что более чем двукратное увеличение активности только промотора CMV и исключительно в клеточной линии NT2D1 было обнаружено для области генома PIWIL2 вокруг экзона. 7 (рис. 4A), что подтверждает его способность действовать как энхансер.

Рис. 4. PIWIL2 Альтернативный промотор в экзоне 7 действует как энхансер в репортерных конструкциях люциферазы.

Относительную промоторную активность промоторов SV40 и CMV оценивали в репортерных векторах люциферазы из фиг. 3 в двух клеточных линиях: TERA1 и NT2D1 (эмбриональная карцинома, панель A). Промоторы PPP3CC и PHYHIP (панель B) оценивали в репортерных векторах люциферазы из фиг. 3 в четырех клеточных линиях: TERA1 и NT2D1 –эмбриональная карцинома, Tcam2 –семинома и A549 – карцинома легкого.Сводка P-значения непарного U-критерия Манна-Уитни представлена ​​для пиков, показывающих более чем двукратное увеличение (над горизонтальными пунктирными линиями) как для прямой, так и для обратной ориентации кандидата в энхансер по сравнению с контролями без энхансера (* — p-значение <0,05, ** - p-значение <0,01).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454.g004

Мы также хотели найти in vivo мишень этого энхансера / альтернативного промотора в экзоне 7 PIWIL2 .Поскольку большинство энхансеров проявляют свою активность в пределах примерно 100Kb и обычно внутри топологически ассоциированного домена (TAD) [52], мы рассмотрели недавно созданную карту геномных взаимодействий с разрешением в килобазах Hi-C (S8 Fig, [53]). PIWIL2 расположен в границах контактного домена, также содержащего гены POLR3D (субъединица РНК-полимеразы III [54]) и PHYHIP (белок, взаимодействующий с фитаноил-CoA 2-гидроксилазой [19]) (S8 Fig). Были сконструированы репортерные векторы люциферазы с экспрессией гена luc , управляемой этими промоторами (S9 фиг.), И геномной областью вокруг экзона 7 PIWIL2 в качестве кандидата в энхансер.Также были использованы еще две контрольные конструкции с кандидатным энхансером и экспрессией luc , управляемой промоторами двух генов, расположенных за пределами PIWIL2 , содержащего контактный домен (S8 и S9 фиг.): KIAA1967 (Регулятор клеточного цикла и апоптоза 2 [55] ) и PPP3CC (тестис-специфическая серин / треонин-протеинфосфатаза [56]).

Неожиданно оказалось, что альтернативный промотор PIWIL2 в экзоне 7 увеличил активность более чем в два раза только по сравнению с промотором PHYHIP (рис. 4B), но не с POLR3D и двумя контролями, что демонстрирует промотор-специфическое действие энхансеров — один об их внутренних особенностях.Примечательно, что мы также могли наблюдать, что эта энхансерная активность была сильнее в случае прямой ориентации. Фактически, о таких случаях сообщалось ранее, и их связывали с возможностью того, что один или несколько дискретных цис -регуляторных элементов внутри энхансера могут обеспечивать такую ​​ориентационную зависимость [57, 58]. Тем не менее, полагаясь на наиболее консервативное определение энхансера, который увеличивает активность промотора независимо от его ориентации, мы можем утверждать, что альтернативный промотор PIWIL2 в экзоне 7 способен функционировать как энхансер только для промотора PHYHIP .

Мы также изучили данные полимеразы II ChIA-PET (анализ взаимодействия хроматина посредством секвенирования парных концевых меток [59]) из ENCODE [60, 61] и нашли доказательства того, что альтернативный промотор PIWIL2 в экзоне 7 и промотор PHYHIP взаимодействуют в линия клеток человека K562 (K562 Pol2 ChIA-PET Interactions Rep 1 от ENCODE / GIS-Ruan, chr8: 22086341..22087865-chr8: 22143618..22145421,2). Хотя структура TAD является относительно стабильной для разных типов клеток, стадий развития и даже организмов [62–64], специфическое взаимодействие между промотором PHYHIP и экзоном 7 PIWIL2 и, в частности, его динамика требует дальнейшего изучения в дальнейшем. эксперименты.

Заключение

В целом представленные здесь данные предоставляют как косвенные (модификации хроматина и эРНК), так и прямые (анализы репортерной люциферазы) доказательства, предполагающие, что геномная область вокруг экзона 7 гена PIWIL2 действует как энхансер для промотора PHYHIP . В качестве побочного продукта транскрипции эРНК этот внутригенный энхансер также продуцирует альтернативную изоформу мРНК PIWIL2 , которая, в свою очередь, транслируется в новую изоформу белка PIWIL2 [30].Важно отметить, что эта короткая изоформа PIWIL2, лишенная N-концевого домена, проявляет разные свойства и может способствовать онкогенезу в отличие от своего полноразмерного аналога ([29] и наши неопубликованные данные). Хотя необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы проанализировать детали и динамику функции канонических и альтернативных промоторов PIWIL2, насколько нам известно, это первое сообщение о транскрибировании регуляторного элемента и, соответственно, возникновении матрицы мРНК для альтернативной изоформы белка.

С более широкой точки зрения, это открытие открывает новую форму взаимодействия между внутригенными энхансерами и экспрессией генов. Возможный сдвиг в ландшафте геномных энхансеров при заболевании может способствовать нарушению регуляции клеточных процессов за счет генерации новых изоформ белка [65, 66]. Чтобы ответить на эти вопросы, необходимы полногеномные и протеомные исследования.

Дополнительная информация

S1 Рис. Данные FANTOM5 / ENCODE CAGE вокруг гена PIWIL2.

PIWIL2 показаны зелеными горизонтальными полосами на верхней панели (соответствует аннотациям Gencode: ENST00000356766.6, ENST00000521356.1, ENST00000454009.2, ENST00000519884.1). Пики FANTOM5 CAGE изображены в виде стрелок на средней панели (зеленая смысловая цепь, пурпурная антисмысловая цепь) и сопровождаются либо номером пика (например, p1 @ PIWIL2), либо его точными геномными координатами (например, p @ chr8: 22140624–22140625). Необработанный сигнал ENCODE CAGE отображается на нижней панели в TMP (количество тегов CAGE на миллион считываний).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454.s001

(PDF)

S2 Рис. Данные консорциума по картированию эпигеномики NIH.

Изучение состояния хроматина с использованием ChromHMM, основанного на многомерной скрытой марковской модели. Базовая модель с 15 состояниями (5 баллов, 127 эпигеномов), основанная на первичных данных о гене PIWIL2.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454.s002

(PPTX)

S3 Рис. Данные консорциума по картированию эпигеномики NIH.

Изучение состояния хроматина с использованием ChromHMM, основанного на многомерной скрытой марковской модели. Модель с 25 состояниями (12 баллов, 127 эпигеномов), основанная на вмененных данных вокруг экзонов 1–14 гена PIWIL2.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454.s003

(PPTX)

S4 Рис. Сегментация хроматина на основе наборов данных ENCODE о модификациях гистонов, данных открытого хроматина и данных о специфическом связывании TF.

Используя два разных метода неконтролируемого машинного обучения (ChromHMM и Segway), геном был автоматически сегментирован на непересекающиеся сегменты. Консенсусная унифицированная сегментация (комбинированная) также была получена путем согласования результатов отдельных сегментов.Также представлены слоистые треки модификации хроматина h4K4me1 в клеточных линиях ENCODE Tier 1 и Tier 2 (верхняя часть) и транскрипционный фактор ChIP-seq (нижняя часть).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454.s004

(PPTX)

S5 Рис. Канонические и альтернативные промоторные области PIWIL2, используемые в анализах репортерных векторов люциферазы.

Просмотр в браузере генома UCSC областей промотора (отмечены красными стрелками) вместе с слоистыми треками модификаций хроматина h4K4me1, h4K27ac и h4K4me3 в клеточных линиях ENCODE Tier 1 и Tier 2 (верхняя часть), кластеры гиперчувствительности DNaseI, фактор транскрипции ChIP-seq и предполагаемые сайты связывания факторов транскрипции (средняя часть), а также необработанные сигналы ChIP-seq h4K4me1, h4K4me3, h4K27ac и h4K27me3 для линий клеток K562, HeLa-S3 и NT2D1 из ENCODE (нижняя часть, два эксперимента для линии клеток K562, проведенных на показаны разные лаборатории).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454.s005

(PPTX)

S6 Рис. Неполиаденилированная транскрипция между экзон-экзонными соединениями гена

qRT-PCR использовали для оценки уровня общей РНК и ее фракции полиА + и рассчитывали отношение общей РНК к фракции полиА +. Были исследованы образцы семиномного и несеминомного рака яичка, а также прилегающие нормальные ткани яичка.

https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0156454.s006

(PDF)

S7 Рис. Неполиаденилированная транскрипция между экзон-экзонными соединениями гена

qRT-PCR использовали для оценки уровня общей РНК и ее фракции полиА + и рассчитывали отношение общей РНК к фракции полиА +. Были проанализированы четыре клеточные линии: TERA1 и NT2D1 –эмбриональная карцинома, TCam2 –семинома и A549 – карцинома легкого.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156454.s007

(PDF)

S8 Фиг.Контактные домены вокруг PIWIL2 из карты Hi-C с разрешением 1 kb (Rao et al, 2014).

Представлена ​​тепловая карта геномных контактов вдоль chr8: 21 880 000–22 470 000 (hg19). Контактные домены обозначены желтыми прямоугольниками и показаны положения генов PHYHIP , POLR3D , PIWIL2 , принадлежащих к одному и тому же контактному домену. PPP3CC и KIAA1967 также представлены в соседнем контактном домене.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0156454.s008

(PDF)

S9 Фиг. Промоторные области PHYHIP, POLR3D, PPP3CC и KIAA1967, используемые в анализах репортерного вектора люциферазы.

Просмотр в браузере генома UCSC областей промотора (отмечены красными стрелками) вместе с многослойными треками модификации хроматина h4K4me3 в клеточных линиях ENCODE уровня 1 и уровня 2 (активный промоторный знак, верхняя часть каждой панели) и кластеров гиперчувствительности DNaseI (нижняя часть каждой панели).

https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0156454.s009

(PPTX)

Благодарности

Мы благодарим профессора Евгения Свердлова за критическое прочтение рукописи, доктора Дмитрия Дидича за конструкт pGL4.10mP2, доктора Сергея Акопова за помощь в работе с клеточными культурами, доктора Алексея Трякина (Российский онкологический научный центр им. сбор образцов и гистологическая оценка.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: TLA LGN IVG.Проведены эксперименты: ЯВС САК МВЗ ИВГ. Проанализированы данные: YVS SAK IVG. Написал бумагу: IVG.

Список литературы

1. 1. Шпиц Ф, Ферлонг Э. Факторы транскрипции: от связывания энхансера до контроля развития. Природа рассматривает генетику. 2012. 13 (9): 613–26. pmid: 22868264.
2. 2. Бенабдалла Н.С., Бикмор В.А. Регуляторные домены и их механизмы. Колд Спринг Харб Symp Quant Biol. 2015. pmid: 265.
3. 3. Верниммен Д., Бикмор В.А.Иерархия активации транскрипции: от энхансера к промотору. Тенденции Genet. 2015. pmid: 26599498.
4. 4. Дэн Б., Мельник С, Повар ПР. Фабрики транскрипции, петли хроматина и нарушение регуляции экспрессии генов при злокачественных новообразованиях. Семинары по биологии рака. 2013. 23 (2): 65–71. pmid: 22285981.
5. 5. Фейерборн А, повар PR. Почему активность гена зависит от его соседей. Тенденции Genet. 2015; 31 (9): 483–90. pmid: 26259670.
6. 6. Матару Н., Ахитув Н.Незначительные петли в основных складках: петля энхансер-промотор, реструктуризация хроматина и их связь с регуляцией транскрипции и заболеванием. PLoS генетика. 2015; 11 (12): e1005640. pmid: 26632825.
7. 7. Секстон Т., Яффе Э., Кенигсберг Э., Бантиньи Ф., Леблан Б., Хойчман М. и др. Принципы трехмерной складки и функциональной организации генома дрозофилы. Клетка. 2012. 148 (3): 458–72. pmid: 22265598.
8. 8. Нора Е.П., Ладжой Б.Р., Шульц Е.Г., Джорджетти Л., Окамото И., Слуга Н. и др.Пространственное разделение регуляторного ландшафта центра X-инактивации. Природа. 2012. 485 (7398): 381–5. pmid: 22495304; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3555144.
9. 9. Диксон Дж. Р., Селварадж С., Ю Ф, Ким А., Ли Й, Шен Й и др. Топологические домены в геномах млекопитающих, идентифицированные с помощью анализа взаимодействий хроматина. Природа. 2012. 485 (7398): 376–80. pmid: 22495300; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3356448.
10. 10. Хоу Ц., Ли Л., Цинь З.С., Корсес В.Г. Плотность генов, транскрипция и инсуляторы способствуют разделению генома дрозофилы на физические домены.Молекулярная клетка. 2012. 48 (3): 471–84. pmid: 23041285; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3496039.
11. 11. Orom UA, Shiekhattar R. Длинные некодирующие РНК открывают новую эру в биологии энхансеров. Клетка. 2013. 154 (6): 1190–3. pmid: 24034243; PubMed Central PMCID: PMC4108076.
12. 12. Kim YW, Lee S, Yun J, Kim A. Хроматиновая петля и транскрипция эРНК предшествуют активации транскрипции гена в локусе бета-глобина. Biosci Rep.2015; 35 (2). pmid: 25588787; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4370096.
13. 13. Андерссон Р., Санделин А., Данко К.Г. Единая архитектура транскрипционных регуляторных элементов. Тенденции Genet. 2015; 31 (8): 426–33. pmid: 26073855.
14. 14. Core LJ, Мартинс А.Л., Данко К.Г., Waters CT, Siepel A, Lis JT. Анализ формирующейся РНК определяет единую архитектуру инициирующих областей на промоторах и энхансерах млекопитающих. Генетика природы. 2014; 46 (12): 1311–20. pmid: 25383968; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4254663.
15. 15. Ким Т.К., Шихаттар Р.Архитектурные и функциональные сходства между усилителями и промоутерами. Клетка. 2015; 162 (5): 948–59. pmid: 26317464; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4556168.
16. 16. Ковальчик М.С., Хьюз Дж. Р., Гаррик Д., Линч М. Д., Шарп Дж. А., Слоан-Стэнли Дж. А. и др. Альтернативными промоторами выступают интрагенные энхансеры. Молекулярная клетка. 2012. 45 (4): 447–58. pmid: 22264824.
17. 17. Де Фацио С., Бартоничек Н., Ди Джакомо М., Абреу-Гуджер С., Санкар А., Фуная С. и др. Эндонуклеазная активность Mili способствует амплификации пиРНК, которая подавляет элементы LINE1.Природа. 2011. 480 (7376): 259–63. pmid: 22020280.
18. 18. Чех B, Hannon GJ. Одна петля, чтобы управлять ими всеми: цикл пинг-понга и подавление звука, управляемое piRNA. Направления биохимических наук. 2016. pmid: 26810602.
19. 19. Ко Дж. Т., Ли Ч. Х., Ан К. Ю., Ким Дж. К., Бэ С. С., Ким Х. Х. и др. Характеристика специфического для мозга мыши ингибитора ангиогенеза 1 (BAI1) и белка 1, ассоциированного с фитаноил-КоА-альфа-гидроксилазой, нового BAI1-связывающего белка. Brain Res Mol Brain Res. 2001. 87 (2): 223–37.pmid: 11245925.
20. 20. Бескон М., Рахмани З. Тирозин-фосфорилированная и регулируемая киназа 1A с двойной специфичностью (DYRK1A) взаимодействует с белком 1, связанным с фитаноил-КоА альфа-гидроксилазой (PAHX-AP1), специфическим для мозга белком. Int J Biochem Cell Biol. 2005. 37 (4): 775–83. pmid: 15694837.
21. 21. Консорциум GT. Геномика человека. Пилотный анализ экспрессии генотипа-ткани (GTEx): регуляция многотканевого гена у человека. Наука. 2015; 348 (6235): 648–60. pmid: 25954001; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4547484.
22. 22. Меле М., Феррейра П.Г., Ревертер Ф., ДеЛука Д.С., Монлонг Дж., Саммет М. и др. Геномика человека. Человеческий транскриптом в тканях и у людей. Наука. 2015; 348 (6235): 660–5. pmid: 25954002; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4547472.
23. 23. Фог Дж., Райт WC, Loveless JD. Отсутствие контаминации клетками HeLa в 169 клеточных линиях опухолей человека. Журнал Национального института рака. 1977; 58 (2): 209–14. pmid: 833871.
24. 24. Эндрюс П.В., Дамджанов И., Саймон Д., Бантинг Г.С., Карлин С., Дракополи, Северная Каролина и др.Клоны плюрипотентной эмбриональной карциномы, полученные из линии клеток тератокарциномы человека Tera-2. Дифференциация in vivo и in vitro. Лабораторное исследование; журнал технических методов и патологии. 1984. 50 (2): 147–62. pmid: 6694356.
25. 25. Giard DJ, Aaronson SA, Todaro GJ, Arnstein P, Kersey JH, Dosik H, et al. Культивирование опухолей человека in vitro: создание клеточных линий, полученных из серии солидных опухолей. Журнал Национального института рака. 1973; 51 (5): 1417–23.pmid: 4357758.
26. 26. Мизуно Ю., Гото А., Камидоно С., Китадзава С. [Создание и характеристика новой линии клеток опухоли половых клеток яичка человека (TCam-2)]. Nihon Hinyokika Gakkai Zasshi. 1993. 84 (7): 1211–8. pmid: 8394948.
27. 27. Гущанская Е.С., Артемов А.В., Ульянов С.В., Логачева М.Д., Пенин А.А., Котова Е.С. и др. Кластеризация CpG-островков может составлять важный детерминант трехмерной организации интерфазных хромосом. Эпигенетика: официальный журнал Общества метилирования ДНК.2014. 9 (7): 951–63. pmid: 24736527; PubMed Central PMCID: PMC4143410.
28. 28. Орландо В. Картирование хромосомных белков in vivo с помощью иммунопреципитации сшитого формальдегидом хроматина. Направления биохимических наук. 2000. 25 (3): 99–104. pmid: 10694875.
29. 29. Йе Й, Инь Д.Т., Чен Л., Чжоу К., Шен Р., Хе Г и др. Идентификация Piwil2-подобных (PL2L) белков, способствующих онкогенезу. PloS один. 2010; 5 (10): e13406. pmid: 20975993; PubMed Central PMCID: PMC2958115.
30. 30. Гайнетдинов И.В., Скворцова Ю.В., Стукачева Е.А., Быченко О.С., Кондратьева С.А., Зиновьева М.В. и др. Профили экспрессии коротких изоформ PIWIL2 различаются в опухолях семенных клеток яичек различных подтипов дифференцировки. PloS один. 2014; 9 (11): e112528. pmid: 25384072; PubMed Central PMCID: PMC4226551.
31. 31. Консорциум F, RP, Clst, Forrest AR, Kawaji H, Rehli M и др. Атлас экспрессии у млекопитающих на уровне промотора. Природа. 2014; 507 (7493): 462–70. pmid: 24670764; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4529748.
32. 32. Эпигеномика дорожной карты C, Kundaje A, Meuleman W, Ernst J, Bilenky M, Yen A, et al. Интегративный анализ 111 эталонных эпигеномов человека. Природа. 2015; 518 (7539): 317–30. pmid: 25693563; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4530010.
33. 33. Консорциум EP. Интегрированная энциклопедия элементов ДНК в геноме человека. Природа. 2012. 489 (7414): 57–74. pmid: 22955616; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3439153.
34. 34. Онг CT, Corces VG. CTCF: архитектурный белок, связывающий топологию и функцию генома.Природа рассматривает генетику. 2014; 15 (4): 234–46. pmid: 24614316; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4610363.
35. 35. Гомес-Диас Э., Корсес В.Г. Архитектурные белки: регуляторы организации трехмерного генома в судьбе клетки. Trends Cell Biol. 2014; 24 (11): 703–11. pmid: 25218583; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4254322.
36. 36. Панне Д. Энхансома. Curr Opin Struct Biol. 2008. 18 (2): 236–42. pmid: 18206362.
37. 37. Герштейн МБ, Кундаже А., Харихаран М., Ландт С.Г., Ян К.К., Ченг С. и др.Архитектура регулирующей сети человека, полученная из данных ENCODE. Природа. 2012. 489 (7414): 91–100. pmid: 22955619; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4154057.
38. 38. Ван Дж., Чжуанг Дж., Айер С., Лин Х, Уитфилд Т.В., Гревен М.С. и др. Особенности последовательности и структура хроматина вокруг участков генома, связанных 119 факторами транскрипции человека. Геномные исследования. 2012. 22 (9): 1798–812. pmid: 22955990; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3431495.
39. 39. Ван Дж., Чжуан Дж., Айер С., Линь XY, Гревен М.С., Ким Б.Х. и др.Factorbook.org: база данных на основе Wiki для данных о связывании факторов транскрипции, созданная консорциумом ENCODE. Исследование нуклеиновых кислот. 2013; 41 (Выпуск базы данных): D171–6. pmid: 23203885; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3531197.
40. 40. Хоффман М.М., Буске О.Дж., Ван Дж., Вен З., Билмес Дж. А., Благородный WS. Неконтролируемое обнаружение паттернов в структуре хроматина человека посредством геномной сегментации. Природные методы. 2012. 9 (5): 473–6. pmid: 22426492; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3340533.
41. 41.Хоффман М.М., Эрнст Дж., Уайлдер С.П., Кундаже А., Харрис Р.С., Либбрехт М. и др. Интегративная аннотация элементов хроматина из данных ENCODE. Исследование нуклеиновых кислот. 2013. 41 (2): 827–41. pmid: 23221638; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3553955.
42. 42. Эрнст Дж, Келлис М. ChromHMM: автоматизация обнаружения и характеристики состояния хроматина. Природные методы. 2012. 9 (3): 215–6. pmid: 22373907; PubMed Central PMCID: PMCPMC3577932.
43. 43. Банерджи Дж., Рускони С., Шаффнер В.Экспрессия гена бета-глобина усиливается удаленными последовательностями ДНК SV40. Клетка. 1981; 27 (2 Pt 1): 299–308. pmid: 6277502.
44. 44. Лай Ф, Шихаттар Р. Энхансерные РНК: новые молекулы транскрипции. Текущее мнение в области генетики и развития. 2014; 25: 38–42. pmid: 24480293.
45. 45. Планк Дж. Л., Дин А. Усиливающая функция: сведения о механизме и геноме объединены. Молекулярная клетка. 2014; 55 (1): 5–14. pmid: 24996062.
46. 46. Левин М., Каттольо С., Тьянь Р.Зацикливание назад, чтобы шагнуть вперед: транскрипция вступает в новую эру. Клетка. 2014. 157 (1): 13–25. pmid: 24679523; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4059561.
47. 47. Шлюева Д., Стампфель Г., Старк А. Энхансеры транскрипции: от свойств к полногеномным предсказаниям. Природа рассматривает генетику. 2014. 15 (4): 272–86. pmid: 24614317.
48. 48. Zentner GE, Scacheri PC. Отпечаток хроматина элементов энхансера гена. Журнал биологической химии. 2012. 287 (37): 30888–96.pmid: 22952241; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3438921.
49. 49. Ким Т.К., Хемберг М., Грей Дж. М.. Энхансерные РНК: класс длинных некодирующих РНК, синтезируемых энхансерами. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015; 7 (1): a018622. pmid: 25561718.
50. 50. Ким Т.К., Хемберг М., Грей Дж.М., Коста А.М., Медведь Д.М., Ву Дж. И др. Широко распространенная транскрипция энхансеров, регулирующих активность нейронов. Природа. 2010. 465 (7295): 182–7. pmid: 20393465; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3020079.
51. 51.Гайнетдинов И.В., Кондратьева С.А., Скворцова Ю.В., Зиновьева М.В., Стукачева Е.А., Климов А. Отличительные эпигенетические особенности предопухолевых тканей яичка, прилегающих к семиномам и несеминомам. Oncotarget. 2016. pmid: 26843623.
52. 52. ван Аренсберген Дж., ван Стенсель Б., Бассемейкер Х. Дж. В поисках детерминант специфичности взаимодействия энхансер-промотор. Trends Cell Biol. 2014. 24 (11): 695–702. pmid: 25160912; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4252644.
53. 53.Рао С.С., Хантли М.Х., Дюран Н.С., Стаменова Е.К., Бочков И.Д., Робинсон Дж. Т. и др. Трехмерная карта генома человека при разрешении килобаз раскрывает принципы образования петель хроматина. Клетка. 2014. 159 (7): 1665–80. pmid: 25497547.
54. 54. Ким Д.Х., Саетром П., Снов О-младший, Росси Дж. Дж. МикроРНК-направленное подавление транскрипционного гена в клетках млекопитающих. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2008. 105 (42): 16230–5. pmid: 18852463; PubMed Central PMCID: PMC2571020.
55. 55. Kim JE, Chen J, Lou Z. p30 DBC является потенциальным регулятором онкогенеза. Клеточный цикл. 2009. 8 (18): 2932–5. pmid: 19657230; PubMed Central PMCID: PMC2777512.
56. 56. Мурамацу Т., Кинкейд Р.Л. Молекулярное клонирование и хромосомное картирование гена человека для семенников-специфической каталитической субъединицы кальмодулин-зависимой протеинфосфатазы (кальциневрин А). Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях. 1992. 188 (1): 265–71. pmid: 1339277.
57. 57.Swamynathan SK, Piatigorsky J. Ориентационно-зависимое влияние межгенного энхансера на промоторную активность дивергентно транскрибируемых генов Shsp / альфа-B-кристаллина и Mkbp / HspB2 мыши. Журнал биологической химии. 2002. 277 (51): 49700–6. pmid: 12403771.
58. 58. Ли С., Хирш М., Картер П., Асокан А., Чжоу Х, Ву З. и др. Небольшой регуляторный элемент из хромосомы 19 усиливает экспрессию специфичных для печени генов. Gene Ther. 2009. 16 (1): 43–51. pmid: 18701910.
59. 59. Фулвуд М.Дж., Лю М.Х., Пан Ю.Ф., Лю Дж., Сюй Х., Мохамед Ю.Б. и др. Связанный с альфа-эстрогеновыми рецепторами хроматин человека. Природа. 2009. 462 (7269): 58–64. pmid: 198

    ; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC2774924.

60. 60. Ли Джи, Руан Х, Ауэрбах Р.К., Сандху К.С., Чжэн М., Ван П. и др. Обширные промотор-центрированные взаимодействия хроматина обеспечивают топологическую основу регуляции транскрипции. Клетка. 2012. 148 (1-2): 84–98. pmid: 22265404; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3339270.
61. 61. Розенблум К.Р., Слоан К.А., Маллади В.С., Дрезер Т.Р., Леннед К., Киркуп В.М. и др. КОДИРОВАТЬ данные в браузере генома UCSC: обновление за 5-й год. Исследование нуклеиновых кислот. 2013; 41 (выпуск базы данных): D56–63. pmid: 23193274; PubMed Central PMCID: PMC3531152.
62. 62. Дости Дж., Бикмор В.А. Хромосомная организация в ядре — картирование новой территории в Hi-Cs. Текущее мнение в области генетики и развития. 2012. 22 (2): 125–31. pmid: 22265226.
63. 63.Гибкус Дж. Х., Деккер Дж. Иерархия трехмерного генома. Молекулярная клетка. 2013. 49 (5): 773–82. pmid: 23473598; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3741673.
64. 64. Гави-Хелм Y, Кляйн Ф.А., Пакозди Т., Сиглар Л., Нордермейр Д., Хубер В. и др. Петли энхансера кажутся стабильными во время развития и связаны с приостановленной полимеразой. Природа. 2014; 512 (7512): 96–100. pmid: 25043061.
65. 65. Смит Э., Шилатифард А. Биология энхансеров и энхансеропатии. Структурная и молекулярная биология природы.2014. 21 (3): 210–9. pmid: 24599251.
66. 66. Herz HM, Hu D, Shilatifard A. Неисправность энхансера при раке. Молекулярная клетка. 2014. 53 (6): 859–66. pmid: 24656127; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4049186.

Опубликованных статей в рецензируемом журнале