| Код по ОКВЭД | Наименование дополнительного вида деятельности |
|---|---|
| 38.1 | Сбор отходов |
| 38.2 | Обработка и утилизация отходов |
| 43.21 | Производство электромонтажных работ |
| 43.22 | Производство санитарно-технических работ, монтаж отопительных систем и систем кондиционирования воздуха |
| 43.29 | Производство прочих строительно-монтажных работ |
| 43.31 | Производство штукатурных работ |
45. 11 |
Торговля легковыми автомобилями и грузовыми автомобилями малой грузоподъемности |
| 45.19 | Торговля прочими автотранспортными средствами |
| 46.12 | Деятельность агентов по оптовой торговле топливом, рудами, металлами и химическими веществами |
| 46.13 | Деятельность агентов по оптовой торговле лесоматериалами и строительными материалами |
| 46.14 | Деятельность агентов по оптовой торговле машинами, промышленным оборудованием, судами и летательными аппаратами |
| 46.15 | Деятельность агентов по оптовой торговле мебелью, бытовыми товарами, скобяными, ножевыми и прочими металлическими изделиями |
46. 18 |
Деятельность агентов, специализирующихся на оптовой торговле прочими отдельными видами товаров |
| 46.19 | Деятельность агентов по оптовой торговле универсальным ассортиментом товаров |
| 46.31 | Торговля оптовая фруктами и овощами |
| 46.32 | Торговля оптовая мясом и мясными продуктами |
| 46.33 | Торговля оптовая молочными продуктами, яйцами и пищевыми маслами и жирами |
| 46.34 | Торговля оптовая напитками |
| 46.35 | Торговля оптовая табачными изделиями |
46. 36 |
Торговля оптовая сахаром, шоколадом и сахаристыми кондитерскими изделиями |
| 46.37 | Торговля оптовая кофе, чаем, какао и пряностями |
| 46.38 | |
| 46.39 | Торговля оптовая неспециализированная пищевыми продуктами, напитками и табачными изделиями |
| 46.41 | Торговля оптовая текстильными изделиями |
| 46.42 | Торговля оптовая одеждой и обувью |
| 46.43 | Торговля оптовая бытовыми электротоварами |
46. |
Торговля оптовая изделиями из керамики и стекла и чистящими средствами |
| 46.45 | Торговля оптовая парфюмерными и косметическими товарами |
| 46.46 | Торговля оптовая фармацевтической продукцией |
| 46.47 | Торговля оптовая мебелью, коврами и осветительным оборудованием |
| 46.48 | |
| 46.49 | Торговля оптовая прочими бытовыми товарами |
| 46.51 | Торговля оптовая компьютерами, периферийными устройствами к компьютерам и программным обеспечением |
46. 52 |
Торговля оптовая электронным и телекоммуникационным оборудованием и его запасными частями |
| 46.61 | Торговля оптовая машинами, оборудованием и инструментами для сельского хозяйства |
| 46.62 | Торговля оптовая станками |
| 46.63 | Торговля оптовая машинами и оборудованием для добычи полезных ископаемых и строительства |
| 46.64 | Торговля оптовая машинами и оборудованием для текстильного, швейного и трикотажного производств |
| 46.65 | Торговля оптовая офисной мебелью |
| 46.66 | Торговля оптовая прочей офисной техникой и оборудованием |
46. 69 |
Торговля оптовая прочими машинами и оборудованием |
| 46.71 | Торговля оптовая твердым, жидким и газообразным топливом и подобными продуктами |
| 46.72 | Торговля оптовая металлами и металлическими рудами |
| 46.74 | Торговля оптовая скобяными изделиями, водопроводным и отопительным оборудованием и принадлежностями |
| 46.75 | Торговля оптовая химическими продуктами |
| 46.76 | Торговля оптовая прочими промежуточными продуктами |
| 46.77 | Торговля оптовая отходами и ломом |
46. 90 |
Торговля оптовая неспециализированная |
| 47.19 | Торговля розничная прочая в неспециализированных магазинах |
| 47.52 | Торговля розничная скобяными изделиями, лакокрасочными материалами и стеклом в специализированных магазинах |
| 47.78 | Торговля розничная прочая в специализированных магазинах |
| 47.89 | Торговля розничная в нестационарных торговых объектах и на рынках прочими товарами |
| 47.91 | Торговля розничная по почте или по информационно-коммуникационной сети интернет |
| 47.99 | Торговля розничная прочая вне магазинов, палаток, рынков |
49. 41 |
Деятельность автомобильного грузового транспорта |
| 49.41.1 | Перевозка грузов специализированными автотранспортными средствами |
| 49.41.2 | Перевозка грузов неспециализированными автотранспортными средствами |
| 49.41.3 | Аренда грузового автомобильного транспорта с водителем |
| 49.42 | Предоставление услуг по перевозкам |
| 50.20 | Деятельность морского грузового транспорта |
| 50.40 | Деятельность внутреннего водного грузового транспорта |
52. 10 |
Деятельность по складированию и хранению |
| 52.10.9 | Хранение и складирование прочих грузов |
| 52.2 | Деятельность транспортная вспомогательная |
| 52.21.2 | Деятельность вспомогательная, связанная с автомобильным транспортом |
| 52.24 | Транспортная обработка грузов |
| 52.24.2 | Транспортная обработка прочих грузов |
| 52.29 | Деятельность вспомогательная прочая, связанная с перевозками |
| 53.20.31 | Деятельность по курьерской доставке различными видами транспорта |
62. 09 |
Деятельность, связанная с использованием вычислительной техники и информационных технологий, прочая |
| 74.20 | Деятельность в области фотографии |
| 74.30 | Деятельность по письменному и устному переводу |
| 77.39.1 | Аренда и лизинг прочих сухопутных транспортных средств и оборудования |
| 78.10 | Деятельность агентств по подбору персонала |
| 81.29.9 | Деятельность по чистке и уборке прочая, не включенная в другие группировки |
| 82.92 | Деятельность по упаковыванию товаров |
96. 09 |
Предоставление прочих персональных услуг, не включенных в другие группировки |
Яндекс Дзен | Открывайте новое каждый день
Яндекс Дзен | Открывайте новое каждый деньЯндекс.Дзен – это платформа, которая подбирает контент специально для вас. В Дзене есть статьи и видео на разные темы от блогеров и медиа.
Ваш личный Дзен
Дзен понимает ваши интересы и собирает ленту для вас. Он анализирует действия: что вы смотрите, кому ставите лайки, на кого подписываетесь, а после – рекомендует вам и уже любимые источники, и ещё неизвестные, но интересные публикации.
Вы смотрите и ставите лайки
шаг 1
Алгоритм отслеживает это и подбирает контент
шаг 2
Вы видите интересные именно вам материалы
шаг 3
Интересные истории
В Дзене есть популярные медиа и талантливые блогеры. Ежедневно они создают тысячи историй на сотни разных тем. И каждый находит в Дзене что-нибудь для себя.
Примеры публикаций
В Дзене действительно много уникальных статей и видео. Вот несколько примеров популярного сейчас контента.
Дзен — простой, современный и удобный
Посмотрите на главные возможности сервиса и начните пользоваться всеми преимуществами Дзена.
Читайте о своих интересах.
Алгоритмы Дзена понимают, что вам нравится, и стараются показывать только то, что будет действительно интересно. Если источник вам не подходит — его можно исключить.
1/4
Тематические ленты.
С общей ленты со всеми статьями легко переключайтесь на тематические: кино, еда, политика, знаменитости.
2/4
Разнообразные форматы.
Открывайте разные форматы историй для чтения и общения. В приложении удобно читать статьи и смотреть видео, писать комментарии.
3/4
Оставайтесь в курсе событий!
Возвращайтесь к нужным статьям: добавляйте статьи в Сохранённое, чтобы прочитать их позже или сохранить в коллекции. Настройте уведомления, чтобы не пропустить самое интересное от любимых блогеров, медиа и каналов.
4/4
Читайте о своих интересах.
Алгоритмы Дзена понимают, что вам нравится, и стараются показывать только то, что будет действительно интересно. Если источник вам не подходит — его можно исключить.
1/4
Тематические ленты.
С общей ленты со всеми статьями легко переключайтесь на тематические: кино, еда, политика, знаменитости.
2/4
Разнообразные форматы.
Открывайте разные форматы историй для чтения и общения. В приложении удобно читать статьи и смотреть видео, писать комментарии.
3/4
Оставайтесь в курсе событий!
Возвращайтесь к нужным статьям: добавляйте статьи в Сохранённое, чтобы прочитать их позже или сохранить в коллекции. Настройте уведомления, чтобы не пропустить самое интересное от любимых блогеров, медиа и каналов.
4/4
Читайте о своих интересах.
Алгоритмы Дзена понимают, что вам нравится, и стараются показывать только то, что будет действительно интересно. Если источник вам не подходит — его можно исключить.
1/4
Тематические ленты.
С общей ленты со всеми статьями легко переключайтесь на тематические: кино, еда, политика, знаменитости.
2/4
Разнообразные форматы.
Открывайте разные форматы историй для чтения и общения. В приложении удобно читать статьи и смотреть видео, писать комментарии.
3/4
Оставайтесь в курсе событий!
Возвращайтесь к нужным статьям: добавляйте статьи в Сохранённое, чтобы прочитать их позже или сохранить в коллекции. Настройте уведомления, чтобы не пропустить самое интересное от любимых блогеров, медиа и каналов.
4/4
Дзен доступен во всем мире более чем на 50 языках
Смело рекомендуйте Дзен своим друзьям из других стран.
العَرَبِيَّةالعَرَبِيَّةУдобно пользоваться в смартфоне
У Дзена есть приложения для iOS и Android.
Пользуйтесь в браузере
Дзен доступен с любого устройства в вашем любимом браузере. Также Дзен встроен в Яндекс.Браузер.
Удобно пользоваться в смартфоне
У Дзена есть приложения для iOS и Android.
Пользуйтесь в браузере
Дзен доступен с любого устройства в вашем любимом браузере. Также Дзен встроен в Яндекс.Браузер.
Удобно пользоваться в смартфоне
У Дзена есть приложения для iOS и Android.
Пользуйтесь в браузере
Дзен доступен с любого устройства в вашем любимом браузере. Также Дзен встроен в Яндекс.Браузер.
© 2015–2021 ООО «Яндекс», 0+
Дизайн и разработка — Charmer
К сожалению, браузер, которым вы пользуйтесь, устарел и не позволяет корректно отображать сайт. Пожалуйста, установите любой из современных браузеров, например:
Яндекс.Браузер Google Chrome Firefox SafariОб утверждении состава Молодежного правительства Кировской области (утратил силу в соответствии с распоряжением Правительства Кировской области от 25.12.2019 № 390), Распоряжение Правительства Кировской области от 05 декабря 2017 года №59
РАСПОРЯЖЕНИЕ
от 5 декабря 2017 года № 59
Об утверждении состава Молодежного правительства Кировской области
_______________________________________________________________
Документ утратил силу в соответствии с
распоряжением Правительства Кировской области
от 25.
12.2019 № 390
_______________________________________________________________
В соответствии с пунктом 3.2 Положения о конкурсе по формированию Молодежного правительства Кировской области, утвержденного постановлением Правительства Кировской области от 15.05.2007 № 94/210 «Об образовании Молодежного правительства Кировской области» (с изменениями, внесенными постановлениями Правительства Кировской области от 07.07.2011 № 110/308, от 30.11.2011 № 130/626, от 21.04.2015 № 34/199, от 24.08.2015 №56/528, от 30.05.2016 № 103/333):
1. Утвердить состав Молодежного правительства Кировской области согласно приложению.
2. Признать утратившим силу распоряжение Правительства Кировской области от 03.07.2015 № 255 «Об утверждении состава Молодежного правительства Кировской области».
3. Контроль за выполнением распоряжения возложить на заместителя Председателя Правительства области Курдюмова Д.А.
4. Настоящее распоряжение вступает в силу через десять дней после его официального опубликования.
Губернатор —
Председатель Правительства
Кировской области И.В. Васильев
Приложение
УТВЕРЖДЕН
распоряжением Правительства
Кировской области
от 5 декабря 2017 года № 59
СОСТАВ Молодежного правительства Кировской области
1. БЕРДИНСКИХ Евгений Владимирович
2. БОРТНИКОВ Максим Андреевич 3 БУТОРИНА Анастасия Ильинична
4. ВЕКУА Георгий Давидович
5. ГОВОРОВ Александр Александрович
6. ЕФРЕМОВА Надежда Сергеевна
7. ЗАБОЛОТСКАЯ Анастасия Александровна
8. ИСТОМИН Александр Владимирович
9. КОЛУПАЕВА Юлия Юрьевна
10. КУЗЬМИН Ярослав Вячеславович
11. КУЗЬМИНЫХ Дмитрий Михайлович
12. ЛЕВАДНЫЙ Александр Анатольевич
13. ЛИМОНОВ Максим Юрьевич
14. МОРОЗОВ Николай Викторович
15. ШИХОВ Владислав Андреевич
менеджмент в индустрии гостеприимства и туризме» (Санкт-Петербург) — Национальный исследовательский университет «Высшая школа экономики»
Выпускные квалификационные работы (ВКР) в НИУ ВШЭ выполняют все студенты в соответствии с университетским Положением и Правилами, определенными каждой образовательной программой.
Аннотации всех ВКР в обязательном порядке публикуются в свободном доступе на корпоративном портале НИУ ВШЭ.
Полный текст ВКР размещается в свободном доступе на портале НИУ ВШЭ только при наличии согласия студента – автора (правообладателя) работы либо, в случае выполнения работы коллективом студентов, при наличии согласия всех соавторов (правообладателей) работы. ВКР после размещения на портале НИУ ВШЭ приобретает статус электронной публикации.
ВКР являются объектами авторских прав, на их использование распространяются ограничения, предусмотренные законодательством Российской Федерации об интеллектуальной собственности.
В случае использования ВКР, в том числе путем цитирования, указание имени автора и источника заимствования обязательно.
Реестр дипломов НИУ ВШЭ
2019
Козлова Евгения Сергеевна
Хорева Любовь Викторовна
2019
Заболотская Анастасия Андреевна
2019
Маленцова Полина Степановна
2019
Фокина Алина Александровна
2019
Гибадуллина Ляйсан Маратовна
2019
Халипина Екатерина Алексеевна
2019
Малофеева Мария Нодарьевна
2019
Костюкова Евгения Олеговна
2019
Семенова Анастасия Михайловна
2019
Кудрявцева Мария Андреевна
2019
Кругликова Елизавета Денисовна
2019
Паншина Наталья Дмитриевна
2019
Сахарова Анастасия Александровна
2019
Шатунова Мария Валентиновна
Хорева Любовь Викторовна
2019
Ильина Дарья Владиславовна
2019
Конина Яна Александровна
2018
Шаробаева Мария Вадимовна
Хорева Любовь Викторовна
2018
Манойлова Валерия Александровна
Хорева Любовь Викторовна
2018
Тихонова Анастасия Александровна
2018
Кудрявцев Николай Сергеевич
Хорева Любовь Викторовна
2018
Святуненко Александра Евгеньевна
2018
Слепинина София Константиновна
2018
Шарая Елизавета Алексеевна
2018
Жукова Ольга Алексеевна
2018
Жорова Яна Вадимовна
2018
Ходиниту Эмилия Ильгаровна
2018
Варблане Анжелика —
2018
Никольская Маргарита Владимировна
2018
Зернова Александра Николаевна
II Санкт-Петербургский международный фестиваль «Опера – всем»
Второй фестиваль «Опера – всем» прошел с 12 июля по 20 июля 2013 года.
Гости уже ставшего популярным open air наряду с шедеврами русской оперной классики услышали жемчужины западноевропейской оперы. Все спектакли сопровождались аншлагами. За два года фестиваль посетили около 40 тысяч человек.
12 июля 2013 Соборная площадь Петропавловской крепости «Жизнь за царя» Михаил Глинка.
Опера Глинки «Жизнь за царя», как самое яркое воплощение патриотизма в оперном искусстве, была приурочена к 400-летию Дома Романовых. Символично, что состоялся спектакль в самом сердце Санкт-Петербурга на Соборной площади Петропавловской крепости рядом с захоронением семьи Романовых.
Режиссёр — Юлия Прохорова
Дирижёр – Фабио Мастранджело
Исполнители: Александр Матвеев (Сусанин), Светлана Юрченко (Антонида), Елена Кнапп (Ваня), Сергей Алещенко (Собинин), Оркестр Государственного Эрмитажа,
Камерный хор Смольного собора под управлением заслуженного артиста России Владимира Беглецова.
14 июля 2013 Исаакиевская площадь «Фауст» Шарль Гуно.
Режиссёр — Виктор Высоцкий
Дирижёр — Фабио Мастранджело
Исполнители: Оркестр Государственного Эрмитажа, Артем Коротков, Наталья Евстафьева, Михаил Никаноров, Тамара Марченко, Молодежный камерный хор Филармонического общества Санкт-Петербурга.
17 июля 2013 Соборная площадь Петропавловской крепости «Трубадур» Джузеппе Верди
В 2013 год отмечался 200-летний юбилей итальянского композитора Джузеппе Верди, опера «Трубадур» была посвящена этой дате.
Режиссёр — Василий Заржецкий
Дирижёр — Сергей Стадлер
Исполнители: Виктор Коротич, Вячеслав Луханин, Владислав Лесик, Елена Кнапп, Александра Попандопуло, Государственный симфонический оркестр Санкт-Петербурга, Петербургский Камерный хор.
20 июля 2013 Елагин остров «Евгений Онегин» Пётр Чайковский
Режиссёр — Элина Амромина
Дирижёр — Виктор Соболев
Исполнители: Петр Мигунов, Владимир Целебровский, Ольга Георгиева, Анастасия Мещанова, Анастасия Виноградова-Заболотская, Людмила Шкиртиль, Оркестр и хор Театра оперы и балета Санкт-Петербургской консерватории.
«Жизнь за царя» М.Глинки:
Шарль Гуно «Фауст»
«Евгений Онегин»:
|
|
|
З список нерюнгринцев«Славянский базар в Витебске» 2016
В июле 2016 года состоялся 25-й Международный фестиваль искусств «Славянский базар в Витебске» в Республике Беларусь.
События фестиваля прошли с участием Государственного секретаря Союзного государства Г.А. Рапоты, а также министров культуры двух стран – В.Р. Мединского (Россия) и Б.В. Светлова (Беларусь). В рамках фестиваля в музее-усадьбе художника Ильи Репина в Здравнево состоялся очередной IV белорусско-российский пленэр юных художников и журналистов из России и Беларуси, который находится под патронатом Союзного государства. На него прибыли по 10 юных художников и 10 юных журналистов из России и Беларуси. В число участников вошли два лучших учащихся нашей школы: Постникова Полина и Заболотская Анастасия. Руководителем нашей делегации от Москвы была назначена преподаватель школы Бондарева Марина Валерьевна. «ДХШ им. И.Е.Репина» была приглашена для участия в фестивале Генеральным директором ЗАО «Творческие мастерские», Председателем оргкомитета пленэра юных художников, писателем, лауреатом премии «Бронзовый микрофон» и высшей премии Союза писателей России «Имперская культура» В.В. Носовым.
Организаторами мероприятия участникам была предложена интересная и насыщенная программа.
В рамках фестиваля проходила художественная выставка юных художников «Пролетая с Шагалом над Витебском». В экспозицию выставки вошли работы учащихся нашей школы. Так-же на смотровой площадке Витебска была организована выставка лучших пленэрных работ всех участников фестиваля. Ученица нашей школы Арина Заболоцкая была восхищена общей атмосферой Витебска, и встречей юных художников двух стран:
– Очень интересное у нас получается общение. Мы делимся опытом, сравниваем свои работы, технику. Пленэр, проводимый в дни фестиваля «Славянский базар» позволяет встретиться с множеством интересных людей, получить очень яркие, незабываемые впечатления. Пленэр активно широко был освещен в СМИ. Наша делегация была приглашена на записи теле- и радиопрограмм. На мероприятии присутствовали многие заслуженные деятели культуры. Работу интерактивных площадок обеспечивали ведущие специалисты и мастера декоративно-прикладного творчества, были представлены выставочные площадки с проведением обучающих мастер-классов «ART – майстэрия», «Белорусская вышиванка и бисероплетение», «Маляванка», «Волшебство создания сувениров из кожи», «Соломенные чудеса.
Белорусские куклы и ангелочки из подручного материала», «Изготовление воздушных змеев», «Флористика от студии Salix », «Мастерим игрушки всей семьей со студией «Лемари». Нашей школой был проведен мастер-класс по декоративно-графическому искусству. Этот мастер-класс с успехом провела М.В. Бондарева.
В музее-усадьбе Ильи Репина «Здравнево», где проходил белорусско-российский пленэр юных художников, по итогам которого участники мероприятий получали поздравления и подарки от Государственного секретаря Союзного государства и министров культуры России и Беларуси.
В память о состоявшемся пленэре в репинской усадьбе гости праздника высадили розы.
Фамилия Заболоцкая
Имя для Заболоцкой
- Ирина Заболоцкая 4
- Елена Заболоцкая 4
- Галина Заболоцкая 4
- Светлана Заболоцкая 3
- Юлиана Заболоцкая 2 Виктория Заболоцкая 2 Яна Заболоцкая 2
- Виктория Заболоцкая 2
- Валерия Заболоцкая 2
- Валентина Заболоцкая 2
- Татьяна Заболоцкая 2
- Татьяна Заболоцкая 2
- Таня Заболоцкая 2
- Полина Заболоцкая 2 000
- Оксана Заболоцкая 2 000
- Оксана Заболоцкая 2 000
- Оксана Заболоцкая 2 000
- Оксана Заболоцкая 2 000
- Оксана Заболоцкая 2
- Наталья Заболоцкая 2
- Наталья Заболоцкая 2
- Настя Заболоцкая 2
- Надежда Заболоцкая 2
- Мариша Заболоцкая 2
- Марина Заболоцкая 2
- Мария Заболоцкая 2
- Мария Заболоцкая 2
- Мария Заболоцкая 2
- Мария Заболоцкая 2
- 006
- Людмила Заболоцкая 2
- Лилия Заболоцкая 2
- Лена Заболоцкая 2
- Лариса Заболотская 2
- Лана Заболоцкая 2
- Ксения Заболоцкая 2
- Ксения Заболоцкая 2 000 Ксения Заболоцкая 2000 Ксения000 Ксения000 Ксения
- Евгения Заболоцкая 2
- Евгения Заболоцкая 2
- Елена Заболоцкая 2
- Екатерина Заболоцкая 2
- Дарина Заболоцкая 2
- Анна Заболоцкая 2 000 Анастасия
- Анна Заболоцкая 2 000 Анастасия Анастасия
- Александра Заболоцкая 2
- Алена Заболоцкая 2
- Юлочка Заболоцкая
- Юлия Заболоцкая
- Юлия Заболоцкая
- Викуска Заболоцкая
- 000 Вика Заболоцкая
- 000 Вика Заболоцкая
- 000 Вика Заболоцкая otskaya
- Танечка Заболоцкая
- Тамара Заболоцкая
- Снежана Заболоцкая
- Саргылана Заболоцкая
- Sandra Заболоцкая
- Раиса Заболоцкая
- Пелагея Заболоцкая
- Оля Заболоцкая
- Olia Заболоцкая
- Oktavia Заболоцкая
- Оксана Заболоцкая
- Нина Заболоцкая
- Ника Заболоцкая
- Natali Заболоцкая
- Nasya Заболоцкая
- Nadya Заболоцкая
- Nadi Заболоцкая
- Mira Заболоцкая
- Машка Заболоцкая
- Маша Заболоцкая
- Мэри Заболоцкая
- Любови Заболоцкая
- Лилиана Заболоцкая
- Леся Заболоцкая
- Lara Заболоцкая
- Кристина Заболоцкая
- Катя Заболоцкая
- Каролина Заболоцкая
- Каролина Заболоцкая 900 05 Juli Заболоцкая
- Feliksada Заболоцкая
- Эмма Заболоцкая
- Елизавета Заболоцкая
- Даша Заболоцкая
- Дарья Заболоцкая
- Кристина Заболоцкая
- Caroline Заболоцкая
- Ася Заболоцкая
- Ариадна Заболоцкая
- Аня Заболоцкая
- Ann Заболоцкая
- Ani Заболоцкая
- Алевтина Заболоцкая
- Александра Заболоцкая
Опечатки и Misspells
zabolotskyaa, zbaolotskaya, zaoblotskaya, zabolotskay, zabolotskayaa, zsbolotsksys, zabolottskaya, zabollotskaya, zabolotskayae, zabolotskayai, zabolotskayaoЛучших изображений для Заболоцких
Игроков / Тренеры Трансферов движения в Россия
Переводы в других странах ——————————- ABAABA LeagueAlbaniaAlgeriaAlpe Adria CupAmerican SamoaAngolaAnguillaAPBLArgentinaArmeniaAustraliaAustriaBahamasBalkan LeagueBaltic LeagueBarbadosBasketball Лиги чемпионов LeagueBasketball чемпионов AmericasBelarusBelgiumBelizeBoliviaBosniaBrazilBulgariaCambodiaCameroonCEBLCEWLChileChinaColombiaCosta RicaCroatiaCubaCyprusCzech RepublicDenmarkDominican RepublicECBLEcuadorEgyptEl SalvadorEstoniaEurocupEuroleagueEWBLFIBA Европа CupFijiFinlandFranceGeorgiaGermanyGreeceGuamHollandHungaryIBAIBLIcelandIndonesiaIranIrelandIsraelItalyJamaicaJapanJBAJordanKazakhstanKosovoKuwaitKyrgyzstanLatviaLebanonLiga SudamericanaLithuaniaLuxembourgMadagascarMaltaMBLMexicoMLBAMoldovaMontenegroMoroccoNABLNAIANBANBA G LeagueNBLCanadaNCAA1NCAA2NCAA3New CaledoniaNew ZealandNigeriaNorth MacedoniaNorwayPanamaPapua Новый GuineaParaguayPBLPeruPhilippinesPolandPortugalPuerto RicoQatarRomaniaRussiaSamoaSaudi ArabiaScotlandSenegalSerbiaSlovakiaSloveniaSouth Afri caSouth KoreaSpainSurinamSwedenSwitzerlandSyriaTahitiTaiwanThailandTongaTRBLTunisiaTurkeyUBLUkraineUnited Арабские EmiratesUnited CupUnited KingdomUruguayVanuatuVenezuelaVTB Объединенных LeagueWABATransfers в других странах ——————————- ABAABA LeagueAlbaniaAlgeriaAlpe Adria CupAmerican SamoaAngolaAnguillaAPBLArgentinaArmeniaAustraliaAustriaBahamasBalkan LeagueBaltic LeagueBarbadosBasketball чемпионов LeagueBasketball Лиги чемпионов AmericasBelarusBelgiumBelizeBoliviaBosniaBrazilBulgariaCambodiaCameroonCEBLCEWLChileChinaColombiaCosta RicaCroatiaCubaCyprusCzech RepublicDenmarkDominican RepublicECBLEcuadorEgyptEl SalvadorEstoniaEurocupEuroleagueEWBLFIBA Европа CupFijiFinlandFranceGeorgiaGermanyGreeceGuamHollandHungaryIBAIBLIcelandIndonesiaIranIrelandIsraelItalyJamaicaJapanJBAJordanKazakhstanKosovoKuwaitKyrgyzstanLatviaLebanonLiga SudamericanaLithuaniaLuxembourgMadagascarMaltaMBLMexicoMLBAMoldovaMontenegroMoroccoNABLNAIANBANBA G LeagueNBLCanadaNCAA1NCAA2NCAA3New CaledoniaNew Zea landNigeriaNorth MacedoniaNorwayPanamaPapua Новый GuineaParaguayPBLPeruPhilippinesPolandPortugalPuerto RicoQatarRomaniaRussiaSamoaSaudi ArabiaScotlandSenegalSerbiaSlovakiaSloveniaSouth AfricaSouth KoreaSpainSurinamSwedenSwitzerlandSyriaTahitiTaiwanThailandTongaTRBLTunisiaTurkeyUBLUkraineUnited Arab EmiratesUnited CupUnited KingdomUruguayVanuatuVenezuelaVTB United LeagueWABA
Обновлено: 23 февраля 2021 г.
Игроков присоединились
Игроков осталось
Игроков осталось
Бесплатные агенты
Игроков присоединились
Игроков осталось
Игроков осталось
Бесплатные агенты
Игроков присоединились
Игроков осталось
Игроков осталось
Бесплатные агенты
Игроков присоединились
Игроков осталось
Игроков осталось
Бесплатные агенты
Игроков присоединились
Игроков осталось
Игроков осталось
Игроков присоединились
Игроков осталось
Игроков осталось
Бесплатные агенты
Игроков присоединились
Игроков осталось
Игроков осталось
Бесплатные агенты
Игроков присоединились
Игроков осталось
Игроков осталось
Бесплатные агенты
Игроков присоединились
Игроков осталось
Игроков осталось
HD обои: женщины, модель, рыжая, голые плечи, портрет, солнечные лучи, Анна Заболоцкая
HD обои: женщины, модель, рыжая, голые плечи, портрет, солнечные лучи, Анна Заболоцкая | Обои Flare женщины, модель, рыжая, голые плечи, портрет, солнечные лучи, Анна Заболоцкая, HD обои Информация об оригинальных обоях: Размер изображения: 1600x900px Размер файла: 249.
13 КБ WallpaperFlare — это открытая платформа, на которой пользователи могут делиться своими любимыми обоями. Загружая эти обои, вы соглашаетесь с нашими Условиями использования и Политикой конфиденциальности. Это изображение предназначено только для использования в качестве обоев рабочего стола. Если вы являетесь автором и обнаружите, что это изображение используется без вашего разрешения, сообщите DMCA, пожалуйста, свяжитесь с нами Выберите разрешение и загрузите эти обоиЗагрузите эти обои как настольные ПК и ноутбуки (включая разрешения 720P, 1080P, 2K, 4K, для обычных ПК и ноутбуков HP, Lenovo, Dell, Asus, Acer):
Загрузите эти обои как рабочий стол iMac:
iMac 21.5-дюймовый дисплей со светодиодной подсветкой:
1920×1080Загрузите эти обои как рабочий стол MacBook:
MacBook Air 13 дюймов, MacBook Pro 15.4 дюйма:
Полный размер — 1440×900MacBook Pro с дисплеем Retina 13,3 дюйма, MacBook Air с дисплеем Retina 13 дюймов, MacBook Air 13,3 дюйма (2020, M1):
2560×1600Загрузите эти обои как рабочий стол с двумя мониторами:
Скачать эти обои как рабочий стол на тройном мониторе:
Скачать эти обои как рабочий стол для четырех мониторов:
Загрузите эти обои как рабочий стол iPhone или экран блокировки:
iPhone 2G, iPhone 3G, iPhone 3GS:
320 x 480iPhone 4, iPhone 4s:
640 x 960iPhone 5, iPhone 5s, iPhone 5c, iPhone SE:
640×1136iPhone 6, iPhone 6s, iPhone 7, iPhone 8:
750×1334iPhone 6 plus, iPhone 6s plus, iPhone 7 plus, iPhone 8 plus:
1242×2208iPhone X, iPhone Xs, iPhone 11 Pro:
1125×2436iPhone Xs Max, iPhone 11 Pro Max:
1242×2688iPhone Xr, iPhone 11:
828×1792iPhone 12 mini:
1080×2340iPhone 12, iPhone 12 Pro:
1170×2532iPhone 12 Pro Max:
1284×2778Загрузите эти обои в качестве рабочего стола телефона Android или экрана блокировки (для обычных телефонов Samsung, Huawei, Xiaomi, Oppo, oneplus, Vivo, LG, Lenovo с Android):
Загрузите эти обои как рабочий стол iPad или экран блокировки:
iPad, iPad 2, iPad Mini:
768×1024, 1024×768iPad 3, iPad 4, iPad Air, iPad Air 2, iPad 2017 г.
, iPad Mini 2, iPad Mini 3, iPad Mini 4, 9.7-дюймовый iPad Pro: 2048×1536, 1536×2048 iPad Pro 10,5 дюйма:
2224×1668, 1668×2224iPad Pro, 11 дюймов:
2388×1668, 1668×2388iPad Pro 12,9 дюйма:
2732×2048, 2048×2732iPad Air 10,9 дюйма:
2360×1640, 1640×2360iPad 10,2 дюйма:
2160×1620, 1620×2160Загрузите эти обои в качестве рабочего стола или экрана блокировки планшетов Surface и Android:
Похожие HD обои
1600 Икс 947 px
женский топ с открытыми плечами синий, модель смотрит вдаль2200 Икс 1467 px
женский зеленый топ с открытыми плечами, Michelle Lit, модель, лицо, портрет1920 г. Икс 1200 px
женское колье с черным воротником, джулия санер, лицо, модель, брюнетка2048 Икс 1152 px
белое женское платье с открытыми плечами, Павел Черепко, модель, длинные волосы2048 Икс 1367 px
женское лицо, женщины, модель, брюнетка, зеленые глаза, голые плечи2048 Икс 1367 px
женский черный топ с открытыми плечами, модель, рыжая, очки, красная помада4160 Икс 2748 px
портрет, женщины, модель, лицо, голые плечи, руки в волосах1920 г. Икс 1200 px
The Photo Fiend, женщины на улице, голые плечи, лицо, портрет1365 Икс 2048 px
красная помада, модель, женщины, смотрит на зрителя, улыбается, брюнетка1280 Икс 872 px
женщины, модель, блондинка, портрет, смотрит на зрителя, глубина резкости1364 Икс 2048 px
женский бордовый топ на тонких бретелях, Paweł Paoro Witkowski, портретный дисплей1080 Икс 1349 px
женский черный топ с открытыми плечами, модель, брюнетка, декольте, Arianny Celeste2048 Икс 1366 px
женский черный топ на бретелях, блондинка, лицо, голубые глаза, сочные губы1920 г. Икс 1200 px
женское черное мини-платье на бретельках, BMW, модель, ножки, ступни2048 Икс 1339 px
женские синие джинсы, блондинка, лицо, голые плечи, высокие каблуки2970 Икс 2000 г. px
Ниемира, модель, девушки, брюнетка, голые плечи, прямые волосы1728 Икс 2160 px
Анастасия Щеглова, Макс Пыжик, девушки, модель, блондинка, портрет1920 г. Икс 1080 px
женское розовое платье без рукавов, модель, брюнетка, длинные волосы, азиатка2048 Икс 1422 px
женский белый топ с открытыми плечами, модель, Алиса Тарасенко, Денис Дрожжин2048 Икс 1157 px
женское черное платье без бретелей, Анастасия Щеглова, Иван Горохов1400 Икс 933 px
женщины, модель, лицо, портрет, рыжая, голубые глаза, женщины на открытом воздухе3840 Икс 5760 px
женское красное платье на тонких бретелях, Gloria Sol, высокие каблуки, красное платье2048 Икс 1355 px
женский черный кружевной топ с открытыми плечами, блондинки, лицо, женщины на открытом воздухе1920 г. Икс 1200 px
женская бежевая помада, модель, брюнетка, длинные волосы, лицо, открытый рот4500 Икс 3001 px
женское красное клетчатое платье, брюнетка, модель, глубина резкости2048 Икс 1426 px
женщины, модель, блондинка, голубые глаза, лицо, губы, голые плечи2560 Икс 1600 px
портрет, женщины, модель, лицо, голые плечи, руки в волосах2048 Икс 1274 px
женщины, портрет, голубые глаза, лежа на спине, голые плечи, лицо2048 Икс 1152 px
женское синее платье, модель, Георгий Чернядьев, рыжая, длинные волосы1920 г. Икс 1080 px
Скарлетт Йоханссон, портрет, знаменитость, актриса, блондинка, женщины1280 Икс 1920 г. px
женская майка бирюзового цвета, модель, рыжая, длинные волосы, портретный дисплей2048 Икс 1286 px
Шон Арчер, портрет, блондинка, лицо, модель, женщины, зеленые глаза1920 г. Икс 1200 px
голые плечи, лицо, макияж, длинные волосы, женщины, модель, красотка1600 Икс 1068 px
женский серый свитер, Алиса Тарасенко, модель, лицо, смотрит на зрителя1920 г. Икс 1327 px
женское красное мини-платье без рукавов, Alina Gladsome, модель, брюнетка2048 Икс 1376 px
женщины, лицо, портрет, смотрит в сторону, голые плечи, косы2048 Икс 1365 px
Эбби Шарлотта, женщины, модель, блондинка, смотрит в сторону, на открытом воздухе1280 Икс 1918 г. px
девушки, модель, брюнетка, длинные волосы, Лиза Соберано, лицо, портрет1620 Икс 1080 px
женская вересковая серая майка, блондинка, портрет, джинсовые шорты
org/ImageObject» data-w=»552″ data-h=»310″>2048 Икс 1152 px
женщины, лицо, портрет, голые плечи, простой фон, красота
org/ImageObject» data-w=»388″ data-h=»310″>2048 Икс 1638 px
женский белый кроп-топ, модель, блондинка, белые топы, профиль, живот
org/ImageObject» data-w=»466″ data-h=»310″>5681 Икс 3787 px
женщины, модель, брюнетка, голые плечи, смотрит на зрителя, портрет
org/ImageObject» data-w=»552″ data-h=»310″>2560 Икс 1440 px
женщины, модель, женщины в помещении, брюнетка, майка, голые плечи
org/ImageObject» data-w=»465″ data-h=»310″>1600 Икс 1067 px
женщины, рыжая, лицо, портрет, Анна Заболоцкая, длинные волосы
org/ImageObject» data-w=»552″ data-h=»310″>1600 Икс 900 px
женский топ с открытыми плечами черно-бежевого цвета с цветочным принтом, Георгий Чернядьев
org/ImageObject» data-w=»443″ data-h=»310″>2048 Икс 1436 px
сияние, голые плечи, лицо, портрет, женщины, модель, Ксения Кокорева
org/ImageObject» data-w=»466″ data-h=»310″>2048 Икс 1365 px
Эбби Шарлотта, женщины, модель, блондинка, смотрит на зрителя, на природе
org/ImageObject» data-w=»552″ data-h=»310″>1920 г. Икс 1080 px
рыжая, женщины, лицо, модель, голые плечи, портрет, выстрел в голову
org/ImageObject» data-w=»388″ data-h=»310″>1340 Икс 1072 px
девушки, модель, брюнетка, портрет, смотрит на зрителя, татуНеповолене ФК | Наше поколение
A-
Анна София Робб
Аманда Сейфрид
Анна Поппвел
Элис Исааз
Ариана Гранде
Анна Фейт
Эшли Грэм
Алексис Велл
Алиса Брагина
Алиса Тарасенко 902 9024 Анна Калацкая 9024 Алена Шишон Анна
Алисия Викандер
Алисия Дебнам-Кэри
Анджелина Кравчик
Алина Акилова
Ая Уоррен
Ана де Армас
Адриана Родригес
Анюта Рай
Анджела Влайсавлевич
Анна Лена Боус
Алина Каленич
Анна Павлова
Анастасия Передистова
Аспен Мэнсфилд
Алина Кучерявая
Алика Эчмидт
Амели Вайссенбергер
Альберта Берлин
Анастасия Макаренко
Александра Тикерпуу
Алиша Бо
Анна Спекхарт
Александра Гирская
Алиса Пагани
Амина Эпендиева
B-
Бриджит Саттерли
Барбара Палвин
Брайана Холли
Брайден Дженкинс
Богдана Кадрицкая
Белла Торн
Белла Боули
C / CH-
Carice van Houten
Cariba Heine
Clementine Levy
Cierra Pangrac
Crystal Reed
Claire Estabrook
Ciara Bravo
Courtney Nicole Kelly
Холд Клэр
Кортни Николь Келли (Дитто)
Констанце Саеманн
Селин Бетманн
D-
Дилан Гвин
Дебора Энн Уолл
Дарья Милки
Дарья Гончарова
Дарья Сидорчук
Дарья Лебедева
Даниэль Роуз Рассел
Дена Каплан
Даника Пиенаар
Дейзи Ридли
Доми Дарнит
E-
Эмма Уотсон
Elle Fanning
Eva Green
Ella Purnell
Evanna Lynch
Ekaterina Diorr
Emma Stone
Elouise Morris
Elsa Hosk
Ebba Zingmark
Ekaterina Koba
Elizma Wheelandum
Emma Wheelandum
F-
Фрейя Мавор
Фрида Густавссон
G-
Джиллиан Андерсон
Грейси Ланкастер
Джиджи Хадид
Грейс Элизабет
Джулия Маенца
Габриэль Стаченко
H-
Хелена Маттссон
Halston Sage
Ханна Херфурт
Хайден Панеттьери
Ханна Эдвинсон
I / Y-
Имоджен Путс
Яэль Шелбия
J-
Дженнифер Моррисон
Дженнифер Конелли
Джоан Фроггатт
Джулия Ярошенко
Джулия Адаменко
Джейд Вебер
Джессика Клементс
Джессика Грин
Джозефина Фрида Петтерсен
Янина Вильгратер
Джейд Растольдо
Джозефин Лэнгфорд
K-
Ксения Яшкина
Кэтрин Лэнгфорд
Кейт Хадсон
Кира Найтли
Кэтрин Ньютон
Кайли Дженнер
Кендалл Дженнер
Кимберли Маклафлан
Катаржина Маркевич
Кристина Крайт 902
Корнелия Лыжи
Катарина Пудар
Пляж Кайла Лотарингия
Ксения Исламова
Кристина Базан
L-
Laneja Grace
Lauren Cohan
Lily Collins
Lili Reinhard
Louise Pedersen
Lauren de Graaf
Lindsay Lohan
Laura Marano
Liza Gulyaewa
Laura Whitmore 902 Grace 902 Carry Leighton 902 Carry Leighton 902 Leighton 902
Логан Браунинг
Лиза Мари Шиффне
Луиза Шнайдер
Линдси Морган
Лу Руат
Лилия Курк
Лиза Диас Фернандес
M-
Мэгги Линдеманн
Магдалена Залейска
Майя Митчелл
Мэллори Янсен
Мегурин Лука
Матильда Бернмарк
Манон Креспи
Милла Йовович
Милана Курникова
Мелани Татитро 24 Мичеллева Милена Ви
Мирада Отто
Мали-Коа Капюшон
Мод Херст
Мария Жгенти
Майя Степпер
Миа Алвес
Майли Сайрус
Mackenzie Foy
Maja Strojek
Maddy Perinovic
Марина Ласвик
Мария Попова
Morgan Lyn
Меган Фокс
N-
Нагиса Шиота
Ньяким Гатвеч
Натали Дормер
Нида Карим
Николь Кидман
Нэнси Джуэл МакДони
Настя Жидкова
Наоми Скотт
Натали Литвинова
Никола Пельц
O-
Оливия Холт
Оливиа Харриет
Оливия Кук
P-
Фиби Тонкин
Pyper America Smith
Paige Reifler
Pauline Hoarau
Костюк Полина
Памела Рейф
Литвинова Полина
R-
Риз Уизерспун
Райли Расмуссен
Регина Калфорния
Робин Марджолейн Хольцкен
Рубиновая роза
Рози Би
S-
Сара Уэйн Кэллис
Саммер Бишил
Сальма Хайек
Суй Хэ
Шелли д’Инферно
София ДиДжорджио
Сандра Буллок
София Карсон
Скарлетт Йоханссон
Шакира
Соня Бенар Сэра 24 Шакира 902 Соня Бенар Сэра 24 Сара 902 Эллен
Стефани Джерманотта
Саша Кичигина
Софи Найт
София Карсон
Снежана Янченко
Сара Люксенбург
Севвал Серенн
Шейла Макгилтон
T-
Тейлор Свифт
Тейлор Хилл
Тесса Грейнер
Тилан Блондо
Труди Грейс
Таши Родригес
Тассия Боутман
Тейлор Лашэ
Таня Кизко
U-
V / W-
Вивиан Спелбрингер
Виктория Джастис
Уиллоу Шилдс
Ванесса Морган
Ванесса Мо
Ваня Ягник
Вика Бронова
Влада Мировинская
Виктория Моролес
Х-
Z-
Zara Larsson
A-
Alejandro Corzo
Adam Sallet
Andrew Garfield
Airon Nik
Andre Hamann
Alex Prange
Alex Michael Lange
Alex Høgh Andersen
Остин Виктория
Альфред Энох
Адриен Сахорес
Арон Пайпер
B-
Бен Барнс
Брандом Т.
Джексон
Бранко Мазель
Бенн Хили
Бен Дальхаус
Брэндон Флинн
Блейк Стивен
Боб Морли
C / CH-
Colton Heynes
Chris Hemsworth
Colin Ford
Christopher Mason
Cole Monahan
Cole Sprouse
Charles Mcbryde
Chase Mattson
D-
Дэвид Бекхэм
Дэвид Ойелоуо
Дэниэл Дэй-Льюис
Дилан О’Брайен
Данило Фонсека
Дэвид Огастик
Дэниел Рэдклифф
Даррен Блэк
Дуглас Бут
Дэниэл Шарман
Дэниэл Дерискас
Дэниэл Дермитскас
Дэвид Ганди
E-
Эдуардо Норьега
F-
Флориан Невиль
Фабиан Кастро
G-
Гвилим Пью
Грегг Салкин
H-
Хью Джекман
Герман Тёммераас
Гарри Стайлс
Герой Файнс-Тиффин
Хендрик Гислер
Хелдер Афонсо
I / Y-
Идрис Эльба
Иван Мартинес
Иван Козак
J-
Джейми Дорнан
Джек Грейстон
Джо Коллиер
Джордан Кейл Барретт
Джек Гилински
Джоэл Киннаман
Хорхе Дель Рио Ромеро
Йорг Нинк
K-
Кевин Крикман
Кристофер Хивью
Кевин Лютольф
Кен Бек / Кеннет Корсгаард Бек
Кайл Эллисон
Карл Кугельманн
L-
Лаки Блю Смит
Леви Стоке
Лука Хейбл
M-
Mark Harmon
Mads Mikkelsen
Maxence Danet-Faravel
Mikkel Jensen
Mitchell Slaggert
Manu Rios
Mike Pishek
Maria Casals
Marc Schulze
Mete Gürsoy van
Марк Бехер
N-
Николай Костер-Вальдау
Neels Vissers
Ник Фогт
Николас Фолс
O-
Орландо Блум
Оливер Бьеррехуус
P-
Пико Александр
R-
Роберт Дауни мл.
Райане Бенсетти
Рис Кинг
Рафаэль Сэй
S-
Сэм Клафлин
Шон О’Доннелл
Сэм Хьюэн
Стивен Джеймс
Шон Мендес
Сэм Харвуд
Стивен Шеврин
Серхио Карвахал
Сэм Корлетт
Саймон Нессман
T-
Taron Egerton
Tibor Pusch
Travis Fimmel
Tom Busson
Theo James
Thomas Doherty
Tim Borrmann
Tom Holland
Том Корнелисс
Тимоти Гранадерос
U-
В / Вт-
Винсент фон Тьен
Вито Бассо
Виктор Зейтц
Уэйд Поэзин
Уильям Франклин-Миллер
Уэсли Финн Такер
Винс Ковальски
Х-
Z-
Зак Кокс
Зак Эфрон
II ул.Петербургский международный фестиваль «All Together Opera»
Второй Санкт-Петербургский международный фестиваль «All Together Opera» проходил с 12 по 20 июля 2013 года.
Гости уже популярного пленэра смогли услышать сокровища западноевропейской оперы, а также шедевры русской оперной классики. Все выступления собирали толпы людей. За два года фестиваль посетили около 40 000 человек.
12 июля 2013 г. Соборная площадь Петропавловской крепости
«Жизнь за царя» М.Глинки
Опера Глинки «Жизнь за царя», как ярчайшее воплощение патриотизма в оперном искусстве, была приурочена к 400-летию Дома Романовых. Символично, что спектакль прошел в самом центре Санкт-Петербурга на Соборной площади Петропавловской крепости рядом с местом захоронения Романовых.
Режиссер — Юлия Прохорова
Дирижер — Фабио Мастранджело
Исполнители: Александр Матвеев (Сусанин), Светлана Юрченко (Антонида), Алена Кнапп (Ваньпин) Оркестр Эрмитажа, Камерный хор Смольного собора под управлением заслуженного артиста Российской Федерации Владимира Бегельцова.
14 июля 2013 г. Исаакиевская площадь
«Фауст» Шарля Гуно
Режиссер — Виктор Высоцкий
Дирижер — Фабио Мастранджело
24 Государственный Эрмитаж Артист Коротков, Наталья Евстафьева, Михаил Никаноров, Тамара Марченко, Молодежный камерный хор Филармонии Санкт-Петербурга
17 июля 2013 г. Соборная площадь Петропавловской крепости
«Трубадур» Джузеппе Верди
В 2013 году состоялось празднование 200-летия со дня рождения итальянского композитора Джузеппе Верди; Этой дате была посвящена постановка «Il trovatore».
Директор — Василий Заржецкий
Дирижер — Сергей Стадлер
Исполнители: Виктор Коротич, Вячеслав Луханин, Владислав Лесик, Санкт-Петербург, Государственный оркестр им.
Елены Кнапфло, оркестр им. Елены Кнаппло Камерный хор
20 июля 2013 г. Елагин остров «Евгений Онегин» Петр Чайковский
Режиссер — Элина Амромина
Дирижер — Виктор Соболев
26
Владимир Мовлебровский Георгиева, Анастасия Мещанова, Анастасия Виноградова-Заболоцкая, Людмила Шкиртиль, оркестр и хор Театра оперы и балета Санкт-Петербурга.Петербургская консерватория,
Максим Гусельников Изображений
Дом Зарегистрироваться Авторизоваться2018×1365
Wallhaven.cc
Просмотр страницы ВидПомечено: женщины рыжая Анна Заболоцкая Максим Гусельников
2048×1365
Wallhaven.
cc
Помечено: женщины рыжая Анна Заболоцкая Максим Гусельников глядя на зрителя теплица Майка
1600×1000
Wallhaven.
cc
Помечено: женщины рыжая Анна Заболоцкая Максим Гусельников глядя на зрителя теплица Майка
Полный размер — 2048×1280
Wallhaven.
cc
Помечено: Анна Заболоцкая рыжая женщины глядя на зрителя теплица Майка длинные волосы Максим Гусельников
2048×1365
Wallhaven.
cc
Помечено: Анна Заболоцкая рыжая женщины длинные волосы Максим Гусельников
2000×1335
Wallhaven.
cc
Помечено: женщины брюнетка женщины на открытом воздухе город пальто тени для век портрет лицо зима Анастасия Щеглова Максим Гусельников
2500×1668
Wallhaven.
cc
Помечено: Алиса Тарасенко женщины модель Максим Гусельников глядя на зрителя лицо глубина резкости блондинка женщины в помещении фотография камера
Полный размер — 2048×1367
Wallhaven.
cc
Помечено: Максим Гусельников портрет лицо женщины модель
Полный размер — 2048×1367
Wallhaven.
cc
Помечено: женщины модель Максим Гусельников нож 500 пикселей
Полный размер — 2048×1367
Wallhaven.
cc
Помечено: женщины модель брюнетка глядя на зрителя Максим Гусельников
2048×1365
Wallhaven.
cc
Помечено: женщины лицо блондинка портрет голубые глаза Мария Жгенти глядя на зрителя Максим Гусельников
2048×1366
Wallhaven.
cc
Помечено: женщины Анастасия Щеглова блондинка брюнетка напольная лампа татуировка стакан для питья свечи Стул стол черная одежда портрет розовая помада гламурные женщины Максим Гусельников
2000×1250
Wallhaven.
cc
Помечено: женщины брюнетка женщины с оттенками портрет лицо боке ожерелье солнечные очки сочные губы загорелый Анастасия Щеглова Максим Гусельников
Полный размер — 2048×1258
Wallhaven.
cc
Помечено: Максим Гусельников профиль лицо женщины на открытом воздухе голые плечи женщины портрет ветреный глубина резкости Солнечный свет ветер брюнетка
2000×1335
Wallhaven.
cc
Помечено: Ольга Кобзарь Максим Гусельников женщины длинные волосы блондинка веснушки шляпа
Комплементарность концевых областей увеличивает время жизни малых РНК в клетках млекопитающих
Abstract
Две РНК (4.
5SH и 4.5SI) с неизвестными функциями имеют ряд общих черт: небольшая длина (около 100 нуклеотидов), транскрипция РНК-полимеразой III, преимущественно ядерная локализация, присутствие в различных тканях и относительно узкое таксономическое распределение (4 и 3 семейства грызунов, соответственно). Сообщалось, что РНК 4.5SH превращается быстро, тогда как РНК 4.5SI стабильна в клетке, но время их жизни остается неизвестным. Мы показали, что 4.5SH действительно короткоживущий (t 1/2 ∼18 мин), а 4.5SI долгоживущий (t 1/2 ∼22 ч) в клетках асцитной карциномы Кребса.Структуры РНК, определяющие быстрый или медленный распад различных малых клеточных РНК, остаются неизученными. Мы искали структурные особенности РНК, которые определяют короткое время жизни 4.5SH по сравнению с длинным временем жизни 4.5SI РНК. Последовательности генов 4.5SH и 4.5SI РНК были изменены, и человеческие клетки (HeLa) были трансфицированы этими генами. Измеряли скорость распада исходной и измененной РНК.
Комплементарность 16-нуклеотидных концевых областей 4.5SI РНК, как оказалось, вносит вклад в ее стабильность в клетках, тогда как отсутствие такой комплементарности в 4.5SH РНК вызвала его быстрый распад. Обсуждаются возможные механизмы явления.
Образец цитирования: Коваль А.П., Гоголевская И.К., Татосян К.А., Крамеров Д.А. (2012) Комплементарность концевых областей увеличивает время жизни малых РНК в клетках млекопитающих. PLoS ONE 7 (9): e44157. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0044157
Редактор: Георг Стоеклин, Немецкий центр исследования рака, Германия
Поступила: 16.04.2012; Принято к печати: 30 июля 2012 г .; Опубликовано: 12 сентября 2012 г.
Авторские права: © Koval et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.
Финансирование: Работа поддержана программой «Молекулярная и клеточная биология» Российской академии наук и Российского фонда фундаментальных исследований (www.rfbr.ru; грант 11-04-00439). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.
Введение
Большинство типов РНК в клетках млекопитающих стабильны: их время жизни оценивается часами или даже днями. Однако некоторые мРНК недолговечны, и их период полураспада (t 1/2 ) оценивается в минуты. Короткое время жизни таких мРНК связано с необходимостью быстрого изменения клеточного уровня кодируемых ими белков (например, факторов, регулирующих клеточный цикл и пролиферацию).Быстрая деградация обычно происходит из-за присутствия в мРНК элементов, богатых AU [1]. Механизм и регуляция такой деградации мРНК достаточно хорошо изучены [2], [3].
В то же время деградация малых РНК, за исключением тРНК [4], [5] и микроРНК [6], остается неизученной.
малых РНК млекопитающих (70–300 нуклеотидов) были открыты в 70-х годах прошлого века [7] — [9]. Постепенно стало ясно, что они играют важную роль в сплайсинге пре-мРНК (РНК U1, U2, U4, U5, U6, U11 и U12), процессинге пре-рРНК (РНК U3 и U14) и модификации (C / D box РНК и H / ACA-бокс-РНК), а также секреции белка (7SL-РНК), регуляции транскрипции (7SK-РНК) и инициации репликации ДНК (Y-РНК) [10] — [14].В отличие от этих РНК, которые, по-видимому, распространены повсеместно для всех эукариот, существуют небольшие РНК с относительно узким диапазоном распределения (stenoRNAs) [15].
Наиболее изученной среди них является РНК BC1, которая синтезируется РНК-полимеразой III (pol III) в нервной ткани и семенниках (предположительно) всех грызунов, но не других млекопитающих [16], [17]. Обычно в геноме присутствует единственный ген BC1, который является основным геном ID [18], повторяющейся последовательности ДНК, принадлежащей коротким вкрапленным элементам (SINE) [19].
Было показано, что BC1 РНК подавляет трансляцию определенных мРНК в дендритах [20]. РНК BC200 выполняет аналогичную функцию у людей и, вероятно, других высших приматов [20], хотя она произошла от FLAM-C, древнего мономерного Alu SINE [21].
Две изучаемые здесь РНК также принадлежат к группе стеноРНК. 4.5SI РНК присутствует только у грызунов трех родственных семейств: Muridae (мыши, крысы, песчанки), Cricetidae (хомяки, полевки) и Spalacidae (слепыши, крысы-корнеплоды, цокоры) [15], [22]. В тканях тех же грызунов, а также тушканчиков и березовых мышей (Dipodidae) их 4.5SH РНК [23]. Эти РНК имеют одинаковую длину (4.5SI, 98-101 нуклеотид и 4.5SH, 94 нуклеотида) [15], [24], [25] и локализуются преимущественно в ядре. У мышей 4.5SI транскрибируется с трех генов, расположенных на хромосоме 6 на расстоянии 40 т.п.н. [26]. Количество генов 4.5SH значительно выше (700–800) в геномах всех исследованных грызунов; каждый ген 4.5SH является частью тандемно повторяющейся единицы размером 4–5 т.
п.н. [23], [27]. Обе РНК эволюционно родственны SINE: гены 4.5SI РНК, по-видимому, произошли от SINE B2 [28], тогда как 4.Гены 5SH РНК были получены из копии древнего SINE pB1 [29]. Гены этих РНК, а также SINE, транскрибируются с помощью pol III за счет внутреннего промотора, состоящего из двух частей (блоки A и B), в то время как 5′-фланкирующие последовательности также влияют на транскрипцию этих генов [26], [30] . Функция обеих РНК остается неизвестной, хотя была показана ассоциация 4.5SH РНК с поли (A) -содержащими РНК [27], [31]. В отличие от большинства малых РНК млекопитающих, 4.5SH РНК имеет быстрый оборот в клетках мыши [27].Здесь мы сконструировали химерные РНК 4.5SH / 4.5SI, а также модифицировали последовательности двух РНК другими способами и показали, что комплементарность концевых областей РНК 4.5SI способствует ее стабильности в клетках, в то время как отсутствие такой комплементарности в клетках. 4.5SH РНК вызывает ее быстрый распад.
Результаты
Исследование стабильности РНК 4.
5SH и 4.5SISchoeniger и Jelinek [27] изучали кинетику включения [ 3 H] уридина в 4.5SH РНК и пришли к выводу, что эта РНК имеет быстрый оборот в мышиных эритролейкозных клетках.Однако время жизни 4.5SH РНК в этих экспериментах не оценивалось. Мы не нашли сообщений о времени жизни РНК 4.5SI, хотя Ro-Choi et al. [24] предположили его стабильность в клетках. Мы решили проверить устоявшееся представление о скорости оборота двух РНК и использовали простой и надежный метод, основанный на ингибировании транскрипции актиномицином D. На рисунках 1 и 2 показаны результаты обнаружения РНК 4.5SH и 4.5SI, выделенных из мышей. Клетки асцитной карциномы Кребса (КАС) в разные моменты времени после добавления актиномицина D в среду для культивирования клеток.Данные демонстрируют нестабильность РНК 4.5SH и стабильность РНК 4.5SI и позволяют нам оценить их период полураспада как 18 мин и 22 часа соответственно.
Рисунок 1. Определение периода полужизни 4.5SH РНК.
( A ).
Обнаружение 4.5SH и 4.5SI РНК посредством Нозерн-гибридизации в общей РНК, выделенной после добавления актиномицина D к клеткам KAC. 5S рРНК использовали в качестве контроля загрузки. ( B ) Графики, показывающие быстрый распад РНК 4.5SH и стабильность РНК 4.5SI.Каждый график основан на данных трех экспериментов (планки ошибок, стандартное отклонение).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0044157.g001
Рисунок 2. Определение периода полужизни 4.5SI РНК.
( A ) Нозерн-гибридизация 4.5SI РНК и 5S рРНК в общей РНК, выделенной из клеток KAC, подвергшихся действию актиномицина D в течение различных периодов времени. ( B ) Графики, демонстрирующие медленное снижение уровня РНК 4.5SI в клетках после начала ингибирования транскрипции.Высокостабильная 5S рРНК использовалась в качестве контроля загрузки. Планки погрешностей, стандартное отклонение, N = 3.
https://doi.org/10.1371/journal.
pone.0044157.g002
Исследование структурных особенностей, определяющих время жизни РНК 4.5SH и 4.5SI
Можно предположить, что особенности строения определяют разницу в стабильности между 4.5SH и 4.5SI РНК в клетке. Для проверки этой гипотезы были созданы плазмидные конструкции, содержащие химерные гены РНК 4.5SH и 4.5SI (рис.3). Транскрипция таких генов привела к образованию молекул 4.5SH РНК, в которых некоторые части были заменены соответствующими участками 4.5SI РНК. Клетки HeLa (карцинома человека) трансфицировали полученными плазмидными конструкциями, и через 20 ч оценивали период полужизни синтезированной РНК, используя обработку клеток актиномицином D. Природные и химерные РНК 4.5SH / 4.5SI определяли с помощью Нозерн-гибридизация в препаратах тотальной РНК, выделенных в разные периоды времени после введения актиномицина D (рис.4А, Б). Результаты показывают, что делеция 3′-конца (конструкция B ), а также замена 3′-конца (конструкция C ), 5′-конца (конструкция D ) или центрального (конструкция E ) ) области 4.
5SH РНК с соответствующими участками 4.5SI РНК существенно не изменили стабильность этих РНК по сравнению с природной РНК 4.5SH (конструкция A ). Однако одновременная замена 3′- и 5′-концевых областей в 4.5SH РНК (конструкция F ) на соответствующие области 4.5SI РНК существенно увеличивала время жизни химерной РНК. Его период полураспада был оценен как 2 часа (рис. 4C).
Рисунок 3. Нуклеотидные последовательности генов РНК 4.5SH и 4.5SI, а также их производных.
Нуклеотиды последовательностей РНК 4.5SH и 4.5SI показаны красным и синим цветом соответственно. Зеленые буквы соответствуют измененным нуклеотидным последовательностям. Боксы A и B промотора pol III подчеркнуты. T 6–7 на конце конструкции является терминатором pol III.
https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0044157.g003
Рисунок 4. Определение периода полужизни 4.5SH РНК и ее производных в трансфицированных клетках HeLa.
( A ) Обнаружение 4.
5SH РНК, ее производных, 4.5SI РНК и 5S рРНК (контроль нагрузки) посредством Нозерн-гибридизации. ( B ) Кинетика распада РНК, транскрибированных из трансфицированных конструкций. Каждый график основан на данных трех экспериментов по трансфекции (планки ошибок, стандартное отклонение). Среднее время полужизни со стандартными отклонениями для РНК, транскрибируемых из каждой конструкции, кроме H (долгоживущие 4.5SI РНК).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0044157.g004
Эти данные позволили нам выдвинуть две гипотезы. Согласно первой, стабильность 4.5SI РНК определяется ее взаимодействием с белками, распознающими специфические нуклеотидные последовательности на 5′- и 3′-концах этой РНК. Вторая гипотеза основана на предсказании вторичных структур природных и химерных 4.5SH / 4.5SI РНК (рис. 5). Мы предположили, что стабильность РНК 4.5SI обусловлена дополнительным взаимодействием между 5′- и 3′-концевыми областями этой РНК, что приводит к образованию длинного (16 п.
н.) двойного спирального стебля.Такое комплементарное взаимодействие между концами отсутствует в РНК 4.5SH и всех химерных РНК, за исключением РНК, транскрибируемой из конструкции F (рис. 5). Чтобы выбрать между этими двумя гипотезами, мы сделали дополнительную конструкцию, которая содержала ген 4.5SH РНК с 13 нуклеотидными заменами в 3′-концевой области; благодаря этим заменам 3′-область стала комплементарной 5′-области (фиг. 3 и 5, конструкция G ). Период полувыведения полученной РНК оценивается в 2 ч (рис.4Б). Этот результат согласуется со второй гипотезой, то есть комплементарность между концевыми областями РНК увеличивает ее время жизни в клетке.
Рис. 5. Предсказанные вторичные структуры РНК 4.5SH ( A ) и ее производных ( B – G ), а также РНК 4.5SI ( H ).
Нуклеотиды, производные от 4.5SH и 4.5SI, отмечены красными и синими кружками. Нуклеотиды измененных последовательностей отмечены зелеными кружками.
https: // doi.
org / 10.1371 / journal.pone.0044157.g005
4.5SI РНК была исследована аналогичным образом. В этой РНК 11-нуклеотидные участки на 5′- и 3′-концах были изменены отдельно или вместе (рис. 3). Замена последовательности на одном из концов (конструкции I и J ) привела к нарушению комплементарности концов (рис. 6А) и резко снизила время жизни РНК (t 1/2 ∼20 мин) (рис. 6Б, В). Напротив, замена последовательности обоих концов (конструкция K ) восстановила комплементарность и сделала РНК стабильной (рис.6А, Б).
Рис. 6. Влияние концевой ножки на время жизни РНК 4.5SI.
( A ) Предсказанные вторичные структуры РНК, полученных из 4.5SI. (См. Нуклеотидные последовательности соответствующих конструкций на рис. 3). Обозначения такие же, как на фиг. 5. ( B ) Обнаружение РНК, транскрибируемой из конструкций I , J и K , в клетках HeLa, обработанных актиномицином D. 5S рРНК использовали в качестве контроля загрузки.
. ( C ) Кинетика распада РНК, транскрибированной из конструкций I , J , K и H (исходный 4.5SI РНК). Каждый график основан на данных трех экспериментов по трансфекции (планки ошибок, стандартное отклонение). Представлены средние периоды полураспада со стандартными отклонениями только для короткоживущих РНК ( I и J ).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0044157.g006
Таким образом, вторичная структура (а не нуклеотидная последовательность 5′- и 3′-концов) имеет решающее значение для стабильности 4.5SI РНК в клетке. Короткое время жизни 4.5SH РНК является результатом отсутствия комплементарности между ее концевыми областями, тогда как другие механизмы, по-видимому, не участвуют в стабилизации этой РНК в клетке.
Обсуждение
4.5SH РНК принадлежит к редкому типу малых РНК, которые характеризуются коротким временем жизни (t 1/2 ~ 18 мин в клетках KAC).
У человека, шимпанзе и гориллы (но не у других приматов) была обнаружена 117-нуклеотидная РНК, SnaR (малая РНК, связанная с NF90) [32]. Период полураспада РНК составляет 15 мин [33]. Гены SnaR, полученные из Alu-родственных SINE, по-видимому, произошли от 7SL РНК. Эти особенности SnaR напоминают характеристики 4.5SH РНК (его гены являются производными SINE pB1, а также происходят из 7SL РНК).Таким образом, приматы SnaR и грызуны 4.5SH появились в результате параллельной эволюции. Однако, в отличие от РНК 4.5SH, SnaR экспрессируется на высоком уровне только в семенниках, тогда как в других органах его содержание очень низкое или умеренное (мозг). Часть SnaR связана с рибосомами или полисомами, что может указывать на участие этой РНК в контроле трансляции [33]. Однако мы не наблюдали ассоциации 4.5SH РНК с полисомами (К. Татосян, Д. Крамеров, неопубликованные данные).
Pol III транскриптов SINE (которые неспособны к полиаденилированию) также являются короткоживущими малыми РНК. Транскрипты Pol III мышиного SINE B2 без сигнала полиаденилирования (AAUAAA) быстро разрушаются в клетке (t 1/2 ∼40 мин), тогда как полиаденилированные транскрипты B2 стабильны [34].
Скорее всего, поли (A) -связывающий белок (PABP) защищает поли (A) -содержащую SINE-РНК от деградации 3′-эндонуклеазами.
Можно ожидать, что будут найдены другие короткоживущие малые РНК.Сложность их открытия может быть связана с низким числом копий таких РНК в клетке. Несмотря на короткое время жизни 4.5SH РНК, количество ее молекул в клетке довольно велико (13 000), по-видимому, из-за большого количества (700–800) генов, кодирующих эту РНК, в геноме мыши [27]. Однако количество генов других короткоживущих малых РНК может быть намного меньше, что может привести к очень небольшому количеству молекул малых РНК в клетке (см., Например, малая β-тРНК-подобная малая РНК MEN [5]). .Интересно, что, истощая механизм деградации РНК, Preker и соавторы обнаружили так называемые промоторные восходящие транскрипты (PROMPT), которые представляют собой различные низкокопийные, некодирующие и очень быстро распадающиеся РНК [35].
Здесь мы провели поиск структурных особенностей РНК, которые определяют короткое время жизни 4.
5SH по сравнению со временем жизни 4.5SI РНК (t 1/2 ∼22 ч). Эти РНК демонстрируют ряд сходных черт: длина, синтез с помощью pol III, преимущественно ядерная локализация, присутствие в различных тканях, относительно узкое таксономическое распределение и эволюционная связь с SINE. A priori большая разница между временами жизни может быть связана с различием нуклеотидных последовательностей этих двух РНК. Например, 4.5SH РНК может содержать сигналы деградации так же, как короткоживущие мРНК несут богатые AU элементы. С другой стороны, 4.5SI РНК может содержать нуклеотидные последовательности, которые могут специфически связывать белки, предотвращая быструю деградацию РНК.
Мы обнаружили, что замена нуклеотидных последовательностей 4.5SH РНК соответствующими участками 4.5SI РНК не увеличивала значительно время жизни химерного 4.5SH РНК. Эти результаты опровергают гипотезу о том, что первичная структура некоторых регионов определяет время жизни этих двух РНК. С другой стороны, одновременная замена 22 нуклеотидов на 5′-конце и 12 нуклеотидов на 3′-конце (конструкция F) увеличивала время жизни РНК в 6 раз.
Согласно предсказанию вторичной структуры, эта двойная замена приводит к образованию двухспирального стержня (16 п.н. с одним несовпадением), который включает оба конца РНК. Подобный двухспиральный шток (но без несоответствия) можно предсказать для 4.5SI РНК (рис. 5 H ). Мы предположили, что такой стержень, образованный концами РНК, увеличивает время жизни РНК. Чтобы проверить это, 15-нуклеотидный участок на 3′-конце РНК 4.5SH был заменен последовательностью, комплементарной 5′-концу этой РНК (конструкция G ). Было обнаружено, что время жизни этой РНК также в 6 раз больше, чем у исходной РНК 4.5SH. Этот результат доказывает, что именно комплементарность концов РНК, а не первичная структура как таковая, увеличивает время жизни РНК.
Может возникнуть вопрос: почему в этих экспериментах время жизни РНК увеличивается в 6 раз (t 1/2 ∼2 ч), а не намного больше? Возможно, другие элементы вторичной структуры (помимо стебля из 16 пар оснований) также способствуют долгому времени жизни 4.
5SI РНК. Другими словами, вероятно, только вся вторичная структура подлинной 4.5SI РНК обеспечивает ее долгое время жизни (t 1/2 ∼22 ч). Можно предположить, что некоторые белки распознают форму РНК, сформированную ее вторичной структурой, и предотвращают ее распад.Однако этот сложный вопрос остается неизученным. В то же время, заменив концевые области из 11 нуклеотидов на взаимно комплементарные последовательности, мы ясно показали важность комплементарности концов в определении времени жизни 4.5SI РНК. Замена только одного конца (конструкции I и J ) привела к резкому уменьшению времени жизни модифицированной РНК 4.5SI (t 1/2 ∼20 мин), тогда как замена обоих концов сохранила РНК. стабильность на уровне как у родной 4.5SI РНК.
Здесь мы не изучали вторичную структуру РНК ферментативными методами. Нет сообщений об ферментативном исследовании сворачивания 4.5SI РНК. Мы считаем, что этот недостаток знаний не очень значителен в контексте данного исследования: компьютерное предсказание вторичной структуры этой РНК достаточно надежно, поскольку она содержит длинный (16 п.
н.) идеальный стержень (рис. 5, конструкция H ). ). Лабуда и Зиткевич [36] изучали вторичную структуру 4.5SH РНК ферментативными методами, однако столкнулись с некоторыми трудностями.С одной стороны, эти авторы выявили те же самые две шпильки, которые присутствуют в предсказанной структуре 5′-половины этой РНК (Fig. 5A). С другой стороны, противоречивые результаты были получены для 3′-половины 4.5SH РНК: одни и те же сайты часто были разрезаны как одноцепочечными, так и двухцепочечными нуклеазами. Это было интерпретировано как сосуществование многих конформационных форм [36]. Таким образом, 4.5SH РНК не имеет длинных идеальных шпилек, а ее вторичная структура очень динамична.
Способ стабилизации РНК, описанный здесь, не является повсеместным, поскольку многие малые РНК не имеют двойной спирали, образованной комплементарным взаимодействием между концевыми областями.Например, РНК BC1 довольно стабильна, но не демонстрирует комплементарность между двумя концевыми областями; напротив, эта РНК имеет длинные и короткие структуры стебель-петля на 5′- и 3′-концах соответственно [37].
Кроме того, BC1 РНК содержит длинную A-богатую область, расположенную непосредственно перед 3′-стволом; PABP может связывать эту область [38] и вносить вклад в стабильность РНК BC1 в клетках. С другой стороны, стебли длиной 7–12 п.н., образованные комплементарным взаимодействием между 5′- и 3′-концевыми областями, присутствуют в тРНК, 5S рРНК, Y1-5 РНК и т. Д.Несоответствие одного нуклеотида в акцепторном стволе резко снижает уровень тРНК в клетках мыши [5]. Таким образом, акцепторный (концевой) ствол длиной 7 п.о. является возможным фактором стабильности тРНК в клетках. Было обнаружено, что два тринуклеотида CCA были синтезированы на 3′-конце тРНК с несоответствием одного нуклеотида, и такая модификация привела к быстрому распаду РНК [5]. Кажется маловероятным, что тот же самый механизм участвует в быстром распаде 4.5SH РНК, потому что: (i) посттранскрипционное добавление CCA специфично для тРНК и тРНК-подобных транскриптов; (ii) секвенирование кДНК не выявило тринуклеотидов CCA на 3′-конце 4.
5SH РНК [23].
Механизм стабилизации малых РНК за счет образования концевой ножки остается неясным. Можно предположить, что такая двойная спиральная структура защищает РНК от экзонуклеаз (например, Xrn1) и экзосом [39], [40]. Возможно, белки, связывающиеся с длинными двойными спиралями, также участвуют в продлении жизни малых РНК. Существует ряд белков с различными функциями, которые могут специфически связываться с двухцепочечной РНК [41], [42]. Эти вопросы можно изучить с помощью описанной нами системы короткоживущих и долгоживущих РНК.
Материалы и методы
Культивирование клеток, трансфекция, ингибирование транскрипции, выделение РНК
клетки асцитной карциномы Кребса II [43] суспендировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и 10 мМ Hepes, pH 7,0. Клетки (10 7 на мл) осторожно перемешивали при 37 ° C во флаконе с плотно закрытой крышкой. Ингибитор транскрипции, актиномицин D (5 мкг / мл), добавляли к среде и отбирали аликвоты по 5 мл в разные периоды времени.
Клетки собирали центрифугированием, и общую клеточную РНК выделяли с использованием метода тиоцианата гуанидиния [44].
выращивали до 80% конфлюэнтности в чашках Петри диаметром 60 мм с использованием среды DMEM с 10% фетальной телячьей сывороткой. Клетки временно трансфицировали 4,5 мкг плазмидной ДНК с применением реагента для трансфекции TurboFect in vitro (Fermentas, Вильнюс, Литва) в соответствии с протоколом производителя. Актиномицин D (5 мкг / мл) добавляли к клеткам через 20 ч после трансфекции. Затем выделяли общую клеточную РНК в разные периоды времени (от 0 до 180 мин).После осаждения этанолом РНК обрабатывали 100 мкг / мл ДНКазы I, не содержащей РНКаз, при 37 ° C в течение 30 мин и очищали экстракцией хлороформом. Осажденную этанолом РНК растворяли в 40 мкл 0,1% SDS и ее концентрацию измеряли с помощью спектрофотометра NanoDrop 1000.
Плазмидные конструкции
Исходная генная конструкция 4.5SH РНК содержала природную геномную последовательность длиной 50 п.
н. Все конструкции, полученные из гена 4.5SH, также содержали эту вышестоящую последовательность. Конструкция Mmu1 ‘гена 4.5SI РНК мыши [26] и ее производные имели геномную последовательность 87 п.н.Нуклеотидные последовательности генов РНК 4.5SH и 4.5SI были изменены с помощью ПЦР. В случае конструкций D , E , F и I использовали двухцикловую ПЦР. Список праймеров для ПЦР представлен в таблице S1. Продукты ПЦР клонировали в pGEM-T (Promega). Плазмиды выделяли одним из вариантов щелочного метода [45], но без обработки РНКазой. Все конструкции секвенировали, чтобы избежать нуклеотидных замен, вводимых во время ПЦР.
Нозерн-блот-анализ
Равные количества клеточной РНК разделяли денатурирующим электрофорезом в 6% PAAG и переносили на мембрану Hybond-XL (GE Healthcare UK Ltd., Бакингемшир, Англия) полусухим электроблоттингом при 5 В в течение 1,5 ч. РНК 4.5SH, РНК 4.5SI и их химеры были обнаружены гибридизацией с 32 P-меченым зондом, полученным с помощью ПЦР [15], [23] (см.
Рис. S1 для праймеров). Блот инкубировали в течение ночи с зондом в 50% формамиде, 5 × растворе Денхардта, 4 × SSC, 1% SDS и 0,1 мг / мл ДНК спермы лосося при 42 ° C. Мембрану промывали 0,1 × SSC и 0,1% SDS при 42 ° C, экспонировали против рентгеновской пленки и сканировали с помощью Cyclone phosphoroimager.
Компьютерный анализ
Вторичная структура была предсказана для малых РНК с использованием веб-сервера mFold 3.2 с параметрами по умолчанию [46]. Был использован лучший прогноз.
Благодарности
клеток асцитной карциномы Кребса II были щедрым подарком доктора Т.М. Дмитриева у А. Институт физико-химической биологии им. Белозерского МГУ, Россия. Благодарим Андрея Крамерова за редакционную помощь.
Вклад авторов
Разработал и задумал эксперименты: DAK.Проведены эксперименты: АПК ИКГ КАТ. Проанализированы данные: АПК КАТ ДАК. Написал бумагу: ДАК КАТ.
Список литературы
- 1.
Chen CY, Shyu AB (1995) AU-богатые элементы: характеристика и важность в деградации мРНК.
Тенденции Biochem Sci 20: 465–470. - 2. Мукерджи Д., Гао М., О’Коннор Дж. П., Райджмейкерс Р., Пруиджн Г. и др. (2002) Экзосома млекопитающих опосредует эффективную деградацию мРНК, которые содержат элементы, богатые AU. Embo J 21: 165–174.
- 3. Franks TM, Lykke-Andersen J (2007) Белки TTP и BRF зарождаются в процессинге формирования тела, чтобы замолчать мРНК с элементами, богатыми AU. Genes Dev 21: 719–735.
- 4. Chernyakov I, Whipple JM, Kotelawala L, Grayhack EJ, Phizicky EM (2008) Деградация нескольких гипомодифицированных зрелых видов тРНК в Saccharomyces cerevisiae опосредуется Met22 и 5′-3′-экзонуклеазами Rat1 и Xrn1. Гены Дев 22: 1369–1380.
- 5. Wilusz JE, Whipple JM, Phizicky EM, Sharp PA (2011) тРНК, помеченные CCACCA, нацелены на деградацию.Наука 334: 817–821.
- 6.
Бейл С., Свердел М., Лю Х., Цзяо Х, Гофф Л.А. и др. (2010) Дифференциальная регуляция стабильности микроРНК. РНК 16: 1032–1039.
- 7. Вайнберг Р.А., Пенман С. (1968) Монодисперсная ядерная РНК с малой молекулярной массой. J Mol Biol 38: 289–304.
- 8. Ro-Choi TS, Busch H (1974) Низкомолекулярные ядерные РНК. В: Буш Х, редактор. Клеточное ядро. Нью-Йорк: Academic Press. С. 151–208.
- 9. Zieve G, Penman S (1976) Малые виды РНК клетки HeLa: метаболизм и субклеточная локализация.Ячейка 8: 19–31.
- 10. Макарова Ю.А., Крамеров Д.А. (2007) Малые ядрышковые РНК. Мол биол (Моск) 41: 246–259.
- 11. Купер Т.А., Ван Л., Дрейфус Г. (2009) РНК и болезнь. Ячейка 136: 777–793.
- 12. Моазед Д. (2009) Малые РНК в подавлении транскрипции генов и защите генома. Природа 457: 413–420.
- 13. Diribarne G, Bensaude O (2009) 7SK RNA, некодирующая РНК, регулирующая P-TEFb, общий фактор транскрипции.РНК Биол 6: 122–128.
- 14.
Круде Т. (2010) Некодирующие РНК: новые игроки в области репликации эукариотической ДНК. Subcell Biochem 50: 105–118.
- 15. Гоголевская И.К., Крамеров Д.А. (2002) История эволюции РНК 4.5SI и указание на ее функциональность. J Mol Evol 54: 354–364.
- 16. DeChiara TM, Brosius J (1987) Neural BC1 RNA: клоны кДНК обнаруживают неповторяющееся содержание последовательностей. Proc Natl Acad Sci U S A 84: 2624–2628.
- 17.Martignetti JA, Brosius J (1993) Neural BC1 RNA как эволюционный маркер: морская свинка остается грызуном. Proc Natl Acad Sci U S A 90: 9698–9702.
- 18. Kim J, Martignetti JA, Shen MR, Brosius J, Deininger P (1994) Ген РНК грызунов BC1 как главный ген для амплификации ID-элемента. Proc Natl Acad Sci U S A 91: 3607–3611.
- 19. Крамеров Д.А., Вассецкий Н.С. (2011) SINEs. Wiley Interdiscip Rev RNA 2: 772–786.
- 20.
Lin D, Pestova TV, Hellen CU, Tiedge H (2008) Контроль трансляции с помощью малой РНК: дендритная РНК BC1 нацелена на механизм геликазы эукариотического фактора инициации 4A. Mol Cell Biol 28: 3008-3019.
- 21. Martignetti JA, Brosius J (1993) BC200 РНК: продукт нервной РНК-полимеразы III, кодируемый мономерным элементом Alu. Proc Natl Acad Sci U S A 90: 11563–11567.
- 22. Гоголевская И.К., Вениаминова Н.А., Крамеров Д.А. (2010) Нуклеотидные последовательности B1 SINE и 4.5S (I) РНК подтверждают тесную связь цокоров со слепыми землекопами (Spalacinae) и бамбуковыми крысами (Rhizomyinae). Ген 460: 30–38.
- 23. Гоголевская И.К., Коваль А.П., Крамеров Д.А. (2005) История эволюции 4.5SH РНК. Mol Biol Evol 22: 1546–1554.
- 24. Ро-Чой Т.С., Редди Р., Хеннинг Д., Такано Т., Тейлор С. и др. (1972) Нуклеотидная последовательность 4.5S РНК I ядер клеток гепатомы Новикова. J Biol Chem 247: 3205–3222.
- 25. Harada F, Kato N (1980) Нуклеотидные последовательности 4.5S РНК, связанные с поли (A) -содержащими РНК клеток мыши и хомяка. Nucleic Acids Res 8: 1273–1285.
- 26. Гоголевская И.К., Крамеров Д.А. (2010) Гены 4.5SI РНК и роль их 5′-фланкирующих последовательностей в транскрипции генов.Gene 451: 32–37.
- 27. Schoeniger LO, Jelinek WR (1986) 4.5S РНК кодируется сотнями тандемно связанных генов, имеет короткий период полужизни и связана водородными связями in vivo с поли (A) -концевыми РНК в цитоплазме культивируемых клеток мыши. Mol Cell Biol 6: 1508–1519.
- 28. Сердобова И.М., Крамеров Д.А. (1998) Короткие ретропозоны суперсемейства B2: эволюция и применение для изучения филогении грызунов. J Mol Evol 46: 202–214.
- 29. Quentin Y (1994) Появление мастер-последовательностей в семействах ретропозонов, происходящих из 7sl РНК.Genetica 93: 203–215.
- 30. Коваль А.П., Крамеров Д.А. (2009) 5′-фланкирующие последовательности могут существенно влиять на транскрипцию гена РНК 4.5SH с помощью РНК-полимеразы III. Gene 446: 75–80.
- 31.
Harada F, Kato N, Hoshino H (1979) Серия 4. 5S РНК, связанных с поли (A) -содержащими РНК клеток грызунов. Nucleic Acids Res 7: 909–917.
- 32. Parrott AM, Mathews MB (2007) Новые быстро эволюционирующие гоминидные РНК связывают ядерный фактор 90 и обнаруживают ограниченное тканью распределение.Nucleic Acids Res 35: 6249-6258.
- 33. Парротт А.М., Цай М., Батчу П., Райан К., Озер Х.Л. и др. (2011) Эволюция и экспрессия семейства малых некодирующих РНК snaR. Nucleic Acids Res 1485–1500.
- 34. Бородулина О.Р., Крамеров Д.А. (2008) Транскрипты, синтезируемые РНК-полимеразой III, могут быть полиаденилированы AAUAAA-зависимым образом. РНК 14: 1865–1873.
- 35. Прекер П., Нильсен Дж., Каммлер С., Ликке-Андерсен С., Кристенсен М.С. и др.(2008) Истощение экзосом РНК выявляет транскрипцию выше активных промоторов человека. Наука 322: 1851–1854.
- 36.
Labuda D, Zietkiewicz E (1994) Эволюция вторичной структуры в семействе 7SL-подобных РНК. J Mol Evol 39: 506–518.
- 37. Рождественский Т.С., Копылов А.М., Брозиус Дж., Хуттенхофер А. (2001) Структура нейрональной РНК BC1: эволюционное преобразование домена тРНК (Ala) в протяженную структуру стебель-петля. РНК 7: 722–730.
- 38. Муддашетти Р., Ханам Т., Кондрашов А., Бундман М., Якоангели А. и др.(2002) Поли (A) -связывающий белок связан с нейрональными частицами рибонуклеопротеинов BC1 и BC200. J Mol Biol 321: 433–445.
- 39. Lykke-Andersen S, Brodersen DE, Jensen TH (2009) Происхождение и деятельность эукариотической экзосомы. J Cell Sci 122: 1487–1494.
- 40. Джонс К.И., Заболоцкая М.В., Ньюбери С.Ф. (2012) 5 ‘→ 3’ экзорибонуклеаза XRN1 / Pacman и ее функции в клеточных процессах и развитии. Wiley Interdiscip Rev RNA
- 41. Fierro-Monti I, Mathews MB (2000) Связывание белков с дуплексной РНК: один мотив, несколько функций.Trends Biochem Sci 25: 241–246.
- 42.
Saunders LR, Barber GN (2003) Семейство связывающих дцРНК белков: критические роли, разнообразные клеточные функции. Faseb J 17: 961–983.
- 43. Юшок В. Д., Маллалиу Л. Дж., Г. Б. (1956) Свойства клеток асцитной карциномы Кребса 2: вес, размер, удельный вес и содержание белка. Журнал Института Франклина 262: 507–509.
- 44. Chomczynski P, Sacchi N (1987) Одностадийный метод выделения РНК путем экстракции кислотным тиоцианатом гуанидиния, фенолом и хлороформом.Анальная биохимия 162: 156–159.
- 45. Lee SY, Rasheed S (1990) Простая процедура для максимального выхода высококачественной плазмидной ДНК. Биотехники 9: 676–679.
- 46. Zuker M (2003) Веб-сервер Mfold для предсказания сворачивания нуклеиновых кислот и гибридизации. Nucleic Acids Res 31: 3406–3415.
Тенденции Biochem Sci 20: 465–470.
Subcell Biochem 50: 105–118.
Mol Cell Biol 28: 3008-3019.
Гоголевская И.К., Крамеров Д.А. (2010) Гены 4.5SI РНК и роль их 5′-фланкирующих последовательностей в транскрипции генов.Gene 451: 32–37.
5S РНК, связанных с поли (A) -содержащими РНК клеток грызунов. Nucleic Acids Res 7: 909–917.
J Mol Evol 39: 506–518.
Faseb J 17: 961–983.