(A) Верхние панели: анализ IB…

(A) Верхние панели: IB-анализ эндогенного RIG-I в цитозольной и митохондриальной фракциях клеток SVGA, которые были ложно инфицированы или инфицированы SeV (50 HAU / мл) или ZIKV (BRA / 2015, MOI 1 ) в течение 24 часов. Анализ IB на GAPDH (цитозольный белок) и MAVS (митохондриальный белок) служил в качестве контроля чистоты фракции.Нижние панели: WCL исследовали анти-RIG-I, анти-NS3 и анти-GAPDH. (B) Верхняя панель: активность люциферазы IFN-β в клетках HEK 293T, трансфицированных в течение 40 часов репортерной плазмидой IFN-β люциферазы и GST (отрицательный контроль), GST-NS3 из DENV (NGC; положительный контроль) или в возрастающих количествах GST-NS3 из ZIKV (H ​​/ PF / 2013), а затем инфицировали SeV (50 HAU / мл) в течение 20 часов. Активность люциферазы нормализовали к значениям котрансфицированной β-галактозидазы и представляли относительно неинфицированных экспрессирующих GST клеток, установленной на 1.Нижняя панель: IB-анализ WCL с анти-GST и анти-актином. (C) IFN-β-люциферазная активность и анализ IB клеток HEK 293T, трансфицированных в течение 30 часов репортерной плазмидой IFN-β-люциферазы и RIG-I 2CARD вместе с GST (отрицательный контроль), GSTNS3 из DENV (NGC; положительный контроль) , или увеличивающееся количество GST-NS3 от ZIKV (H ​​/ PF / 2013), определенное в соответствии с ( B ). (D) IFN-β-люциферазная активность и анализ IB клеток HEK 293T, трансфицированных в течение 40 часов GST (отрицательный контроль) или GST-NS3 из DENV (NGC; положительный контроль) или указанных штаммов ZIKV, а затем инфицированных SeV ( 50 HAU / мл) в течение 20 часов, определено как в ( B ). (E) Обилие эндогенного ISG (ISG15, ISG54 и RIG-I) или актина (контроль нагрузки) в клетках HEK 293T, трансфицированных в течение 48 часов GST (отрицательный контроль), или GST-NS3 из ZIKV (H ​​/ PF / 2013) или DENV (NGC; положительный контроль), а затем инфицировали SeV (50 HAU / мл) в течение 24 ч, определенное методом IB с указанными антителами. (F) Образование эндогенных филаментов MAVS в клетках HEK 293T, которые были трансфецированы либо GST, либо GST-NS3 (ZIKV) WT, либо KIKP в течение 24 часов, а затем инфицированы SeV (100 HAU / мл) в течение 14 часов, что определяется с помощью полуфабриката. -денатурирующий детергентный электрофорез в агарозном геле (SDD-AGE) митохондриальных экстрактов.WCL далее анализировали с помощью SDS-PAGE и IB с анти-MAVS, анти-GST и анти-актином (контроль нагрузки). (G) Верхняя панель: IFN-β-люциферазная активность клеток HEK 293T, трансфицированных в течение 30 часов GST (отрицательный контроль) или GST-NS3 из ZIKV (H ​​/ PF / 2013) и либо пустым вектором, FLAG-MAVS или RIG -I 2CARD, определяется как в ( B ). Нижняя панель: IB-анализ WCL с анти-GST и анти-актином (контроль нагрузки). Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение (n = 3). * p B – D)] или * p <0,05, ** p <0.01, *** p <0,001 [тест Стьюдента t в ( G )]. нс, статистически не значимо. Данные представляют три ( A, ​​D, F, G), или два ( B, C, E ) независимых экспериментов.

Механизм ингибирования IRSp53 с помощью 14-3-3

Очистка 14-3-3-связывающего компетентного IRSp53

Млекопитающие экспрессируют семь изоформ 14-3-3, обозначенных β, γ, ε, ζ, η, σ, и θ (также называемый τ), и большинство изоформ обогащено тканью мозга ³⁷ , где IRSp53 также присутствует в большом количестве ^7,16 .Было показано, что IRSp53 взаимодействует in vitro и в клетках с несколькими изоформами 14-3-3, включая ζ, γ, θ и σ ^35,36,38,39 . Здесь мы создали условия, которые увеличивают количество IRSp53, который связывает 14-3-3 в клетках млекопитающих, и разработали протокол очистки этого белка в больших количествах для биохимических и фосфопротеомических исследований (рис. 1). Предыдущее сообщение связывало фосфорилирование IRSp53 в T340 и T360 со связыванием 14-3-3 ³⁶ . Эти авторы дополнительно обнаружили, что IRSp53 коимунопреципитирует менее обильно с 14-3-3, когда клетки обрабатывают LiCl, что позволяет им предположить, что киназа, расположенная ниже GSK3β, фосфорилирует IRSp53 по сайтам связывания 14-3-3.Однако другое исследование показало, что мутант Par1b / MARK2, который принимает N ⁶ -бензил-АТФ [ ³⁵ γS] в качестве субстрата, непосредственно фосфорилирует IRSp53 по S366, и на этот сайт приходится наибольшая доля 14-3- 3 опускание с помощью IRSp53 ³⁵ . Par1b / MARK2 является AMPK-родственной киназой ⁴⁰ , и было также показано, что AMPK непосредственно фосфорилирует IRSp53 по S366 с использованием аналогичного подхода к скринингу химической генетики ^41,42 . Поскольку AMPK-родственные киназы являются единственными, которые убедительно доказывают, что они непосредственно фосфорилируют IRSp53, мы использовали сывороточное голодание, которое, как известно, активирует AMPK-зависимое фосфорилирование ⁴³ , для усиления фосфорилирования IRSp53 в клетках HEK293T.Как и ожидалось, сывороточное голодание увеличивало относительное количество эндогенного 14-3-3 (включая все изоформы), которые коиммунопреципитируют с FLAG-IRSp53, и для будущих экспериментов было установлено оптимальное время голодания, равное 2 часам перед лизисом (рис. 1а). В соответствии с предыдущими выводами ^35,41,42 , эти результаты показывают, что AMPK (или родственная киназа) фосфорилирует IRSp53 и что сайты фосфорилирования AMPK по крайней мере частично ответственны за связывание 14-3-3. ³⁵ .

Очистка нативно фосфорилированного и 14-3-3-связывающего компетентного pIRSp53. a Влияние сывороточного голодания на относительное количество 14-3-3 (серые столбцы), коиммунопреципитирующее с IRSp53-FLAG (полоски) из клеток HEK293T. Планки погрешностей — ± стандартное отклонение. из трех независимых экспериментов, показанных светлыми кружками. Обилие сообщается относительно количества экспрессированного IRSp53-FLAG или эндогенного 14-3-3 в питаемых клетках (первая колонка). Обратите внимание, что сывороточное голодание не влияет на экспрессию IRSp53-FLAG, но увеличивает относительное количество 14-3-3, которое коиммунопреципитируется с ним.Оптимальное время голодания 2 часа было установлено из этих экспериментов. b Очистка фосфорилированного IRSp53-FLAG из клеток HEK293T. Клетки голодали по сыворотке в течение 2 часов для усиления фосфорилирования IRSp53. Эндогенный 14-3-3, связанный с IRSp53, конкурентно удаляется путем добавления дважды фосфорилированного пептида IRSp53 Сайтов 2, 3 (дополнительная таблица 1). Компетентная к связыванию 14-3-3 фракция IRSp53 затем выделяется посредством последовательных стадий аффинной очистки (FLAG-аффинность и 14-3-3-аффинность), элюируя IRSp53-FLAG путем конкуренции с пептидами FLAG или Сайтов 2,3. . c Окрашенные кумасси и Pro-Q Diamond гели SDS-PAGE, показывающие, что выделенная фракция IRSp53 является чистой и фосфорилированной

Мы разработали протокол для очистки фосфорилированного и способного к связыванию 14-3-3 IRSp53 (pIRSp53 ) из лишенных сыворотки клеток HEK293T с использованием чередования стадий сродства FLAG и 14-3-3 (рис. 1b). Пептид FLAG и дважды фосфорилированный синтетический пептид IRSp53 (пептид Sites 2,3; см. Ниже) использовали для элюирования IRSp53 из аффинных колонок путем конкуренции.За ходом очистки следили с помощью вестерн-блоттинга (рис. 1b). Анализ SDS-PAGE подтвердил чистоту очищенного белка, который, как было дополнительно показано, фосфорилирован с использованием окрашивания гелем Pro-Q Diamond (Molecular Probes, Юджин, штат Орегон) (рис. 1c).

Характеристика сайтов связывания 14-3-3 pIRSp53

Обзор исследований фосфопротеомики, составленный в PhosphoSitePlus ⁴⁴ , показывает, что IRSp53 в основном фосфорилируется в гибкой, богатой S / T области между CRIB-PR и Sh4-домены (рис.2a), что кажется идеальным местом для связывания 14-3-3 с целью ингибирования взаимодействий CRIB-PR с Cdc42 и домена Sh4 с эффекторами цитоскелета. По совпадению, два исследования идентифицировали 14-3-3-связывающие сайты в этой области, хотя и отличающиеся друг от друга: pT340 / pT360 ³⁶ и S366 и, в гораздо меньшей степени, остаток в кластере ⁴⁵² SSST ⁴⁵⁵ расположен после домена Sh4 ³⁵ . Мы проанализировали с помощью масс-спектрометрии полученный нами высокочистый, 14-3-3-связывающий компетентный препарат pIRSp53 (рис.1в). Пять сайтов были воспроизводимо фосфорилированы в четырех проанализированных образцах (три с двухчасовым голоданием и один без голодания): S325, T340, T360, S366 и остаток в кластере ⁴⁵² SSST ⁴⁵⁵ , скорее всего, S454 (рис. 2а). , красные полосы, дополнительный рисунок 1 и дополнительные данные 1). Эти сайты совпадают с сайтами, обнаруженными с наибольшей частотой в фосфопотеомных исследованиях, и включают сайты, ранее участвовавшие в связывании 14-3-3 ^35,36 .

Характеристика сайтов связывания 14-3-3 pIRSp53. a Доменная организация IRSp53, показывающая расположение сайтов фосфорилирования и определение синтетических фосфопептидов, используемых в этом исследовании. На графике высота каждого сайта фосфорилирования представляет количество раз, когда определенный остаток фосфорилировался в исследованиях фосфопротеомики, проводимых PhosphoSitePlus (www.phosphosite.org). Среди них пять сайтов (выделены красным) были последовательно обнаружены как фосфорилированные в четырех различных образцах pIRSp53, проанализированных здесь (очищенных, как показано на рис.1). Обратите внимание, что пять указанных здесь сайтов совпадают с сайтами с наибольшей частотой в PhosphoSitePlus. b — d ITC титрования 100 мкМ однократно фосфорилированных (сайты 1–5) или 50 мкМ дважды фосфорилированных (сайты 1,2; 2,3 и 2,4) пептидов в 10 мкМ 14-3-3θ ( как указано). ITC-эксперименты проводились при 20 ° C. Для каждого эксперимента указаны константа диссоциации ( K _d ) и стехиометрия связывания ( N ), полученные в результате подбора изотермы связывания (красная линия).Ошибки соответствуют s.d. подходов. e Изменение термодинамических параметров ΔH (оранжевые столбцы), -TΔS (зеленые столбцы) и ΔG (фиолетовые столбцы), полученные из подгонок титрований ITC, показанных на панелях b — d . Ошибки соответствуют s.d. подходов. f Коиммунопреципитация 14-3-3 с WT IRSp53-FLAG и мутантами, несущими замены S / T-> A указанных сайтов фосфорилирования (названных в соответствии с количеством пяти основных сайтов фосфорилирования, показанных в части a ).Обилие сообщается относительно количества эндогенного 14-3-3, который коиммунопреципитируется с WT IRSp53-FLAG в клетках с недостатком сыворотки (первый столбец). Планки погрешностей — ± стандартное отклонение. из трех независимых экспериментов, показанных светлыми кружками. Статистическую значимость измерений определяли с помощью непарного двустороннего теста Стьюдента t , сравнивая каждый из мутантов с WT IRSp53 (нс, незначимо; * p <0,05; *** p < 0,001; **** p <0.0001)

Затем мы спросили, какие из этих сайтов фосфорилирования участвуют в связывании 14-3-3. Поскольку фосфо-S / T-связывающие карманы 14-3-3 находятся на расстоянии ~ 34 Å друг от друга, он может в принципе связываться либо с двумя идентичными сайтами на двух субъединицах димерной мишени, либо с двумя отдельными сайтами на одном полипептиде, в котором В этом случае сайты обычно находятся на расстоянии 19-40 аминокислот друг от друга в пределах внутренних неупорядоченных областей ⁴⁵ . Поэтому мы использовали изотермическую калориметрию титрования (ITC) для проверки идентифицированных здесь сайтов фосфорилирования на их способность связывать Escherichia coli, -экспрессируемый 14-3-3θ индивидуально и парами.Были исследованы восемь синтетических фосфопептидов IRSp53, включая пять однократно фосфорилированных пептидов длиной 12–14 остатков (названные Сайтами 1–5) и три дважды фосфорилированных пептида длиной 29–40 остатков (названные Сайтами 1,2; 2). , 3 и 2,4) (рис. 2а, дополнительная таблица 1 и дополнительный рисунок 2).

Все однократно фосфорилированные пептиды, за исключением сайта 1 (pS325), связывались 14-3-3θ со стехиометрией ~ 1: 1 (т. Е. Два пептида на димер 14-3-3θ) и относительно низкими аффинностями ( K _d от 5.От 5 до 16,5 мкМ) (рис. 2б, д). Дважды фосфорилированный пептид Sites 1,2 (pS325 / pT340) также связывал 14-3-3θ со стехиометрией ~ 1: 1 и микромолярным сродством (рис. 2c, e), предполагая, что он взаимодействует с 14-3-3θ только через Сайт 2 (pT340), таким образом, исключает сайт 1 (pS325) как потенциальный сайт связывания 14-3-3θ. Напротив, пептиды сайтов 2, 3 (pT340 / pT360) и сайтов 2,4 (pT340 / pS366) связывают 14-3-3θ со стехиометрией ~ 0,5: 1 (т.е. один пептид на димер 14-3-3θ) и с более чем на два порядка более высокой аффинностью ( K _d 45 нМ и 67 нМ соответственно), чем соответствующие однократно фосфорилированные пептиды (рис.2г, д). Этот результат предполагает, что эти дважды фосфорилированные пептиды занимают два фосфо-S / T-связывающих кармана 14-3-3θ. Следует отметить, что другие мишени 14-3-3 также связываются с наномолярным сродством и демонстрируют аналогичное увеличение сродства к однократно фосфорилированным по сравнению с дважды фосфорилированными пептидами ^{45,46,47,48,49,50,51} .

Пептид, содержащий pT360 и pS366, не анализировался, потому что эти два сайта находятся слишком близко друг к другу в последовательности, чтобы обеспечить одновременное связывание с симметричными карманами димера 14-3-3.Сайт 5 (pS454), который сам по себе связывал 14-3-3θ с K _d = 12 мкМ (рис. 2b), не мог быть протестирован ITC в комбинации с другими сайтами из-за невозможности получения синтетических пептиды необходимой длины. Однако замена 4-аланином кластера ⁴⁵² SSST ⁴⁵⁵ не повлияла на относительное количество 14-3-3, которое коиммунопреципитируется с IRSp53-FLAG из клеток (рис. 2f), что позволяет нам исключить это. кластер как сайт связывания 14-3-3. Напротив, единичные замены аланином остатков Т340, Т360 и S366 значительно снижают связывание 14-3-3 в клетках, и любая комбинация этих мутаций полностью отменяет связывание 14-3-3 (рис.2е). Важно отметить, что фосфомиметические мутации этих сайтов не могут заменять фосфорилирование в случае связывания 14-3-3; E. coli -экспрессированные фосфомиметические мутанты полноразмерного IRSp53, содержащие аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту в положениях 340, 360, 366 и 454, не смогли связать 14-3-3θ (дополнительная фигура 3). Из совокупности этих результатов мы заключаем, что 14-3-3 связывается с тремя основными сайтами в pIRSp53 (pT340, pT360 и pS366), и его сродство к связыванию увеличивается более чем в 100 раз для двух пар сайтов: pT340 / pT360 и pT340. / pT366.Существование двух пар 14-3-3-связывающих сайтов в pIRSp53 примиряет очевидное несоответствие между результатами двух предыдущих исследований ^35,36 .

Каждая субъединица димера pIRSp53 связывает один димер 14-3-3

Как 14-3-3, так и IRSp53 образуют конститутивные димеры, как и несколько мишеней 14-3-3, включая p53, c-Raf, LRRK2, ASK1 и HSPB6. Недавняя кристаллическая структура HSPB6 в комплексе с 14-3-3σ ⁵² и исследование SAXS pASK1-CD в комплексе с 14-3-3ζ ⁵³ показывают единственный димер 14-3-3, связанный с одним фосфорилированием. сайт в одной из субъединиц этих димерных мишеней.Однако 14-3-3 связывается с некоторыми мишенями через два или более сайтов фосфорилирования, и то, связывается ли 14-3-3 с разными сайтами внутри одной субъединицы или с идентичными (или разными) сайтами на двух субъединицах димерной мишени, является вопросом вопрос, который официально не рассматривался. Мы делаем это здесь для IRSp53, как биохимически, так и в клетках.

В клетках был разработан подход с двумя метками (FLAG, STREP) для очистки гетеродимеров WT IRSp53 и мутанта, в котором остатки T340, T360, S366 и ⁴⁵² SSST ⁴⁵⁵ были одновременно мутированы на аланин ( M2345).Важно отметить, что первая попытка с использованием двух отдельных плазмид для совместной экспрессии WT IRSp53-FLAG и M2345-STREP в клетках HEK293T (дополнительный рисунок 4a) не смогла произвести гетеродимеры (дополнительный рисунок 4b). Этот подход дает только гомодимеры (WT / WT или M2345 / M2345), что убедительно указывает на то, что димеризация IRSp53 происходит во время трансляции и является необратимой. Напротив, гетеродимеры WT / M2345 успешно экспрессировались из одного вектора, кодирующего один продукт транскрипции. Для этого мы вставили внутренний сайт входа в рибосому (IRES) между кодирующими последовательностями WT и M2345, что позволило осуществить одновременную трансляцию двух открытых рамок считывания (рис.3а). Когда обе субъединицы были мутированы, 14-3-3 не коиммунопреципитировал с M2345 / M2345, тогда как ~ 50% количества, которое коиммунопреципитируется с WT / WT IRSp53, наблюдалось, когда одна из димерных субъединиц была мутирована (WT / M2345 или M2345 / WT), независимо от того, какая аффинная метка была присоединена к мутантной субъединице или была ли мутантная субъединица предшествовала или следовала за IRES (рис. 3b). Эти результаты демонстрируют, что 14-3-3 связывается с двумя разными сайтами фосфорилирования на одной субъединице димера pIRSp53 в клетках.

Каждая субъединица димера pIRSp53 связывает один димер 14-3-3. a Иллюстрация стратегии, используемой для получения гетеродимеров IRSp53 дикого типа / мутанта с использованием тегов двойной аффинной очистки (FLAG и STREP) и внутреннего сайта входа в рибосомы (IRES), вставленного между кодирующими последовательностями дикого типа и мутантными последовательностями одной экспрессии плазмида. Мутант M2345 несет семь замен S / T-> A (T340A / T360A / S366A / ⁴⁵² SSST ⁴⁵⁵ -> AAAA). b Коиммунопреципитация 14-3-3 с гомо- и гетеродимерами дикого типа и мутантного IRSp53. Были протестированы два разных гетеродимера, в которых мутантная субъединица либо предшествовала, либо следовала за IRES, что также изменило метку очистки. Обилие сообщается относительно количества эндогенного 14-3-3, который коиммунопреципитируется с WT-IRSp53-FLAG / WT-IRSp53-STREP. Планки погрешностей — ± стандартное отклонение. из трех независимых экспериментов, показанных светлыми кружками. Статистическая значимость измерений определялась с использованием непарного двустороннего теста Стьюдента t , сравнивая каждый из образцов с IRSp53 дикого типа (нс, незначимо; ** p <0.01; **** p <0,0001). c FRET-анализ, в котором меченный акцептором (Alexa 568) пептид сайта 2 титровали до полунасыщенного 14-3-3θ (молярное соотношение 1: 0,5) донором (Alexa 488) -меченным сайтом 2 (пурпурные квадраты) или Участки 2,4 пептидов (синие квадраты). FRET наблюдается только тогда, когда меченный акцептором пептид связывается с одним из карманов димера 14-3-3θ, в то время как другой карман занят меченным донором пептидом (как показано слева). Планки погрешностей — ± стандартное отклонение. из трех независимых экспериментов. d Определение масс комплексов 14-3-3θ с пептидами сайта 2 (черная линия) или сайтов 2,4 (красная линия) с использованием SEC-MALS. Слева показаны протестированные модели взаимодействия и соответствующие массы.

Для дальнейшей проверки взаимодействия 14-3-3 с парами сайтов в одной субъединице димера pIRSp53 был разработан конкурентный анализ FRET для мониторинга связывания акцептора. -меченого пептида сайта 2 с полунасыщенными (стехиометрия 1: 0,5) комплексами 14-3-3θ с пептидами, меченными донором сайта 2 или сайтами 2,4 (рис.3в). Титрование полунасыщенного комплекса 14-3-3θ / сайт 2 привело к значительному увеличению FRET, что указывает на то, что меченный акцептором пептид сайта 2 связывается с вакантным карманом димера 14-3-3θ в пределах расстояния FRET от меченный донором пептид сайта 2 (предварительно связанный с другим карманом 14-3-3θ). Напротив, титрование меченного акцептором пептида Site 2 в комплекс 14-3-3θ / Sites 2,4 не приводило к изменению FRET, предполагая, что оба кармана 14-3-3θ были заняты дважды фосфорилированным пептидом, и что однократно фосфорилированный пептид не может вытеснить дважды фосфорилированный пептид из любого кармана.

Дважды фосфорилированный пептид может в принципе связываться с двумя димерами 14-3-3θ в trans , возможность проверена здесь с использованием многоуглового светорассеяния для измерения масс насыщенных комплексов 14-3-3θ с однократно и дважды фосфорилированные пептиды (фиг. 3d). Экспериментально определенная масса комплекса 14-3-3θ / Участок 2 составляла 58000 Да, что соответствует комплексу 1: 1 (теоретическая масса: 58207 Да), тогда как масса 14-3-3θ / Участки 2,4 составляла 61000 Да. , что соответствует 1: 0.5 (теоретическая масса: 59 838 Да). Эти массы исключают образование комплексов 14-3-3θ в trans с дважды фосфорилированным пептидом Sites 2,4 с теоретическими массами 115 331 Да (один пептид, связанный в trans с двумя димерами 14-3-3θ ) или 119,659 Да (два пептида, связанные в trans с двумя 14-3-3θ димерами). Вместе эти результаты предполагают, что 14-3-3 связывается с двумя парами сайтов (pT340 / pT360 или pT340 / pS366) в одной субъединице димера IRSp53.

Структурная основа взаимодействия 14-3-3 с pIRSp53

Три фактора затрудняют структурную характеристику комплексов 14-3-3 с дважды фосфорилированными пептидами: (а) области низкой сложности между сайтами фосфорилирования являются обычно неупорядочены в структурах комплексов 14-3-3, (b) 14-3-3 связывается с фосфо-S / T сайтами, которые связаны друг с другом и, таким образом, трудно различимы на картах электронной плотности, и (c) дважды -фосфорилированные пептиды могут в принципе связываться с двумя противоположными ориентациями N- и C-конца, так что каждый из карманов 14-3-3 может в принципе содержать смесь двух сайтов фосфорилирования, присутствующих в пептиде.Поэтому, чтобы изучить связывание 14-3-3θ с парами pT340 / pT360 и pT340 / pS366, мы определили пять кристаллических структур, позволяющих напрямую сравнивать структуры однократно и дважды фосфорилированных комплексов (рис. Дополнительный рисунок 5). В структурах с разрешением от 2,0 до 2,9 Å (дополнительная таблица 2) карты электронной плотности выявили фосфорилированный остаток и 3-5 остатков на N- и C-конце к нему, тогда как концы пептидов и гибкие линкеры между сайтами фосфорилирования в дважды фосфорилированных пептидах не были определены.Во всех структурах фосфатная группа на фосфорилированной боковой цепи взаимодействует с кластером основных остатков в 14-3-3θ, состоящем из K49, R56 и R127, и дополнительно образует водородную связь с гидроксильной группой Y128. Для однократно фосфорилированных пептидов электронная плотность симметрична для двух карманов 14-3-3θ (дополнительный рисунок 6), даже если во время уточнения не была наложена двукратная симметрия. Важно отметить, что структуры однократно фосфорилированных пептидов демонстрируют отличительные особенности, которые распознаются в структурах дважды фосфорилированных пептидов, для которых электронная плотность асимметрична в двух карманах 14-3-3θ (рис.4 и дополнительный рисунок 7). В частности, пептиды сайта 2 и сайта 3 содержат остаток пролина во втором положении после сайта фосфорилирования, вызывая характерный 90-градусный изгиб полипептидной цепи, который в результате выходит из бороздки связывания 14-3-3, таким образом оставляя значительная часть канавки не занята (дополнительный рисунок 5a, b и дополнительный рисунок 6a, b). Напротив, пептид сайта 4 имеет остаток аланина во втором положении после сайта фосфорилирования (pS366) и следует относительно прямым путем вдоль бороздки 14-3-3θ (дополнительный рисунок 5c и дополнительный рисунок 6c).Хотя последовательности, окружающие pT340 и pT360, тесно связаны друг с другом, их можно различить по наличию двух больших боковых цепей в пептиде сайта 1, Y337 и R344, занятых меньшими боковыми цепями в пептиде сайта 2, E357 и S365, соответственно (дополнительный рисунок 5а, б). Эти отличительные особенности однократно фосфорилированных пептидов четко различимы в структурах дважды фосфорилированных пептидов (рис. 4a, b), в которых каждый карман 14-3-3θ связывает другой сайт асимметричным образом.Отметим, однако, что структура пары pT340 / pT360 содержит четыре комплекса в элементарной ячейке P1, и только один из этих комплексов имеет уникальную ориентацию дважды фосфорилированного пептида с N-на-C-конца, тогда как остальные три комплекса похоже, имеют смесь ориентаций. Вместе биохимические (рис. 2 и 3) и структурные (рис. 4) данные позволяют нам заключить, что 14-3-3 связывается с высокой аффинностью с двумя парами сайтов в pIRSp53, pT340 / pT360 и pT340 / pS366.

Структуры комплексов 14-3-3θ с дважды фосфорилированными пептидами IRSp53. a , b Комплексы 14-3-3θ с пептидами сайтов 2, 3 и 2,4, демонстрирующие общую структуру (слева) и крупные планы связывающих карманов 14-3-3θ и соответствующих 2 F _o — F _{c Карты электронной плотности} с контуром 1σ (справа). На представленных диаграммах последовательности участки пептидов, наблюдаемые в структурах, выделены черным цветом, а сайты фосфорилирования выделены красным цветом, тогда как неразрешенные аминокислоты показаны серым.Пунктирные линии указывают путь между наблюдаемыми частями связанных пептидов в структурах. Обратите внимание, что последовательности вокруг двух сайтов фосфорилирования каждого пептида достаточно различаются, чтобы их можно было четко различить на картах электронной плотности в отдельных карманах 14-3-3θ (см. Также дополнительный рисунок 7), что подтверждается перекрестными сравнениями с структуры соответствующих однократно фосфорилированных пептидов (дополнительные рисунки 5 и 6)

FRET-сенсорный анализ показывает ингибирование pIRSp53 с помощью 14-3-3

Затем мы спросили, регулирует ли связывание 14-3-3 с pIRSp53 его активность за счет стабилизации закрытой, аутоингибированной конформации, в которой внутримолекулярное взаимодействие между доменами CRIB-PR и Sh4 блокирует доступ к этим двум доменам ¹⁰ .Чтобы проверить эту идею, был разработан FRET-сенсорный анализ для мониторинга конформационных изменений в pIRSp53 в зависимости от его взаимодействия с партнерами по связыванию. Этот подход основан на нашем предыдущем отчете о FRET-сенсоре с использованием E. coli -экспрессированного IRSp53 ¹⁰ , но теперь мы используем протокол очистки, описанный здесь (рис.1), чтобы получить сенсор FRET, изначально фосфорилированный в клетках млекопитающих ( ПИРСп53 _ФС ). Белок, используемый в FRET-сенсорном анализе, был помечен парой донор / акцептор флуоресцеин / родамин в двух положениях: эндогенный C230 в домене BAR (единственный доступный для метки остаток Cys в IRSp53) и C519, введенный мутагенезом рядом с C- terminus (S519 в WT IRSp53).Конформационные изменения в pIRSp53 _FS отслеживали как изменение передачи энергии в результате связывания нескольких входов: 14-3-3θ, Cdc42 и эффектора цитоскелета Eps8 (рис. 5а). Все белки, использованные в этих экспериментах, были очищены до гомогенности (дополнительная фигура 8).

Анализ FRET-сенсора показывает ингибирование pIRSp53 с помощью 14-3-3. a FRET сенсорный анализ, разработанный для сообщения о конформационных изменениях, происходящих в pIRSp53 в зависимости от взаимодействий с партнерами по связыванию.Фосфорилированный IRSp53 (мутант S519C) был экспрессирован и очищен, как показано на фиг.1, и помечен на C230 (в пределах домена BAR) и C519 (около C-конца) с помощью пары донор / акцептор флуоресцеин / родамин (pIRSp53 _FS ) . Во всех реакциях мечения использовали одну и ту же партию зондов и соотношение донор / акцептор. Конформационные изменения в pIRSp53 _FS обнаруживаются на основе количества FRET между флуоресцентными зондами в этих двух удаленных положениях. b , c FRET-титрование 2 мкМ GNPPNP-Cdc42 (мутант G12V) в 0.2 мкМ pIRSp53 _FS (красные квадраты) с последующим титрованием 0,2 мкМ 14-3-3θ (синие квадраты) и титрованием в обратном порядке. d , e FRET титрование 0,2 мкМ Eps8 в 0,05 мкМ pIRSp53 _FS (красные квадраты) с последующим титрованием 4 мкМ 14-3-3θ (синие квадраты) и титрованием в обратном порядке. Пары титрований были нормализованы по общему изменению FRET. Каждое титрование соответствовало функции некооперативного связывания (черные линии), за исключением функции Eps8 в pIRSp53 _FS , которая соответствовала функции кооперативного связывания с неспецифическим связыванием (см. Методы). f Относительная распространенность стягивания вниз 14-3-3 с помощью магнитных шариков анти-Flag в присутствии или в отсутствие комплекса FLAG-Eps8 / pIRSp53. Планки погрешностей — ± стандартное отклонение. из трех независимых экспериментов, показанных светлыми кружками. Статистическая значимость измерений определялась с помощью непарного двустороннего теста Стьюдента t (*** p <0,001). г FRET титрование 2 мкМ GNPPNP-Cdc42 в 0,2 мкМ мутант M234 _FS (красные квадраты) с последующим титрованием 0.2 мкМ 14-3-3θ (синие квадраты)

Титрование GMPPNP-Cdc42 (конститутивно активный мутант G12V) в pIRSp53 _FS индуцировало переход к открытой активной конформации, характеризующейся увеличением флуоресценции донора (т. Е. , состояние с низким FRET) (рис. 5б). Последующее титрование 14-3-3θ в этот комплекс снижает флуоресценцию донора (высокое состояние FRET), что согласуется с обращением конформационных изменений, индуцированных Cdc42, и переходом pIRSp53 в сторону закрытой, неактивной конформации.Когда порядок титрования был изменен, 14-3-3θ запускал переход pIRSp53 _FS в сторону закрытой конформации, которая оставалась в основном неизменной при последующем титровании Cdc42 (рис. 5c). Причина небольшого увеличения передачи энергии при титровании с Cdc42 неясна, но может указывать на неактивирующее связывание Cdc42 с комплексом IRSp53-14-3-3. Эти результаты показывают, что Cdc42 не может конкурентно активировать pIRSp53, если он связан с 14-3-3.

Поскольку связывание эффекторов цитоскелета, таких как Eps8, с доменом Sh4 также активирует IRSp53 ¹⁰ , мы выполнили последовательное титрование 14-3-3θ и Eps8 в pIRSp53 _FS , используя Eps8, очищенный от млекопитающих. ячеек (дополнительный рисунок 8).Связывание Eps8 с pIRSp53 _FS увеличивает флуоресценцию донора кооперативным образом (рис. 5d), что согласуется с переходом pIRSp53 в открытое активное состояние. Как мы показали ранее, ¹⁰ , комплекс Eps8 / pIRSp53 имеет стехиометрию 2: 2. Однако последующее титрование 14-3-3θ в этот комплекс не вернуло конформационное изменение, вызванное Eps8. Напротив, флуоресценция донора возрастала линейно, хотя только на ~ 15% при 4-кратном молярном избытке 14-3-3θ по отношению к Eps8 (рис.5г). Этот эффект, возможно, объясняется неспособностью 14-3-3θ вытеснять Eps8 из его комплекса с pIRSp53, что также подтверждается наблюдением, что Eps8, меченный FLAG, притягивает как pIRSp53, так и 14-3-3θ (рис. 5f). Таким образом, мы пришли к выводу, что связывание 14-3-3θ с Eps8 / pIRSp53 дает тройной комплекс с низким FRET, конформация которого отличается от конформации активных Eps8 / pIRSp53 и ингибированных комплексов 14-3-3θ / pIRSp53, и который мы не можем надежно классифицировать их как открытые или закрытые. Способность 14-3-3θ конкурентно возвращать конформационные изменения, индуцированные Cdc42, но не Eps8, согласуется с относительной аффинностью связывания этих трех белков с pIRSp53; По результатам подбора титров наблюдаемое K _d ( K _obs ) взаимодействий pIRSp53 с Cdc42, Eps8 и 14-3-3θ было оценено как 19.1 мкМ, 0,042 мкМ и 0,079 мкМ соответственно. Затем мы изменили порядок титрований; 14-3-3θ индуцировал ожидаемый переход pIRSp53 в закрытое, неактивное состояние, и последующее титрование Eps8 в этот комплекс не изменило флуоресценцию донора (рис. 5e), предполагая, что даже высокоаффинный эффектор цитоскелета, такой как Eps8 не может конкурентно активировать pIRSp53, если он связан с 14-3-3.

Чтобы проверить, зависит ли влияние 14-3-3θ на конформацию pIRSp53 от связывания с двумя парами сайтов фосфорилирования, идентифицированными выше, мы экспрессировали в клетках HEK293T, лишенных сыворотки, модифицированную версию сенсора FRET (pM234 _FS ), в которых эти сайты были одновременно мутированы на аланин (T340A / T360A / S366A).Как показано выше (рис. 2f), этот мутант не может коиммунопреципитировать с 14-3-3 из клеток. Титрование Cdc42 в pM234 _FS вызвало ожидаемый переход к открытой конформации, но в отличие от pIRSp53 _FS последующее титрование 14-3-3θ не вернуло это конформационное изменение (сравните фиг. 5b, g). Вместе эти результаты предполагают, что 14-3-3 блокирует pIRSp53 в закрытой, аутоингибируемой конформации, блокируя взаимодействия Cdc42 и эффекторов цитоскелета с доменами CRIB-PR и Sh4.

14-3-3 ингибирует связывание pIRSp53 с клеточными мембранами.

Затем мы спросили, ингибирует ли связывание 14-3-3 взаимодействие pIRSp53 с мембранами в клетках. С этой целью мы разделили цитозольную и мембранную фракции клеток HEK293T после подпитки и голодных по сыворотке, экспрессирующих либо WT IRSp53-FLAG, либо мутантный M234-FLAG (неспособный связывать 14-3-3), и определили относительную численность двух IRSp53 строится в двух клеточных фракциях. В питаемых клетках IRSp53-FLAG дикого типа был довольно равномерно распределен между цитозольной и мембранной фракциями, тогда как M234-FLAG был значительно больше во фракции мембран (рис.6а). Голодание сыворотки, состояние, при котором увеличивается количество 14-3-3, коиммунопреципитирующего с FLAG-IRSp53 (рис. 1a), снижает количество WT IRSp53-FLAG, связанного с мембранами, на ~ 13% по сравнению с клетками, получавшими корм, но не имеет значительно влияет на распределение M234-FLAG между цитозольной и мембранной фракциями. Таким образом, мы заключаем, что 14-3-3 не только ингибирует связывание pIRSp53 с Cdc42 и эффекторами цитоскелета, но также препятствует его взаимодействию с клеточными мембранами.

Механизм регулирования IRSp53 по 14-3-3. a 14-3-3 ингибирует связывание pIRSp53 с мембраной. Относительные количества WT IRSp53-FLAG и мутанта M234-FLAG в цитозольной (черные столбцы) и мембранной фракциях (серые столбцы) питаемых и лишенных сыворотки клеток HEK293T определяли путем взвешивания количества IRSp53 или M234 против объединенного количества. GAPDH и β-актина для цитозольной фракции или E-кадгерина для мембранной фракции. Планки погрешностей — ± стандартное отклонение. от трех различных трансфекций и двух экспериментов по трансфекции (показаны пустыми кружками).Статистическая значимость измерений определялась с помощью непарного двустороннего теста Стьюдента t (нс, несущественно; ** p <0,01; *** p <0,001; **** p <0,0001). b Модель активации IRSp53 и ингибирования, зависимого от фосфорилирования, с помощью 14-3-3. IRSp53 активируется связыванием Cdc42 с доменом CRIB-PR и / или эффекторами цитоскелета с доменом Sh4. Активация открывает I-BAR домен для связывания с плазматической мембраной.Фосфорилирование IRSp53 и последующее связывание 14-3-3 с сайтами фосфорилирования, расположенными между доменами CRIB-PR и Sh4, стабилизирует аутоингибируемую конформацию и ингибирует связывание Cdc42 и нижестоящих эффекторов цитоскелета

Разблокирование кода 14-3-3 | Журнал клеточной науки

Одна из самых ярких историй из «грязи к богатству» в мире белков — это история о 14-3-3, первоначально идентифицированном в 1967 году как просто обильный белок мозга.Первые свидетельства того, что 14-3-3 будет играть важную роль в клеточной биологии, появились почти 25 лет спустя, когда было обнаружено, что он взаимодействует с различными протоонкогенными белками и сигнальными белками. Последующая идентификация 14-3-3 как фосфосерин / фосфотреонин-связывающего белка твердо установила его важность в передаче сигналов в клетке. 14-3-3 членов семейства встречаются у всех эукариот — от растений до млекопитающих — и на сегодняшний день идентифицировано более 100 партнеров по связыванию. Мишени 14-3-3 обнаруживаются во всех субклеточных компартментах, и их функциональное разнообразие огромно — они включают факторы транскрипции, ферменты биосинтеза, белки цитоскелета, сигнальные молекулы, факторы апоптоза и супрессоры опухолей.Связывание 14-3-3 может изменять локализацию, стабильность, состояние фосфорилирования, активность и / или молекулярные взаимодействия целевого белка. Недавние исследования показывают, что серин / треониновые протеинфосфатазы PP1 и PP2A являются важными регуляторами взаимодействий связывания 14-3-3 и демонстрируют роль 14-3-3 в контроле транслокации определенных белков из цитоплазматического и эндоплазматического ретикулума в плазматическая мембрана. Новые сообщения также связывают 14-3-3 с несколькими неопластическими и неврологическими расстройствами, где он может способствовать патогенезу и прогрессированию этих заболеваний.

Семейство белков 14-3-3 было первоначально идентифицировано в 1967 году Муром и Пересом во время систематической классификации белков мозга (Moore and Perez, 1967). Фактически, название «14-3-3» обозначает элюируемую фракцию, содержащую эти белки, после хроматографии DEAE-целлюлозы и их положение миграции после последующего электрофореза в крахмальном геле. Помимо их описания как кислых белков с молекулярной массой ~ 30 кДа, в этой первоначальной характеристике было обнаружено немногое еще.Однако за годы, прошедшие с момента их открытия, белки 14-3-3 заняли важное место в клеточной биологии, поскольку было показано, что они вносят свой вклад в регуляцию таких важных клеточных процессов, как метаболизм, передача сигналов, контроль клеточного цикла. , апоптоз, транспорт белков, транскрипция, стрессовые реакции и злокачественная трансформация. Благодаря появлению новых исследовательских инструментов, таких как антитела, распознающие мотив связывания 14-3-3, а также пептиды-ингибиторы, наряду с продолжающимся поиском белковых интеракторов, все еще открываются новые мишени 14-3-3.Более того, дальнейшая характеристика известных взаимодействий 14-3-3 продолжает обеспечивать понимание функции и регуляции 14-3-3. Здесь мы кратко исследуем основы «14-3-3-ology», а затем сосредотачиваем наше обсуждение на недавних исследованиях, изучающих механизмы, которые регулируют связывание с мишенью 14-3-3, расширяющуюся роль 14-3-3 в перемещении белков. и растущее значение 14-3-3 в болезнях человека. Для более подробного обсуждения изоформ 14-3-3, структуры и свойств связывания читатель может обратиться к нескольким превосходным обзорам (Aitken, 2002; Fu et al., 2000; Цивион и Авруч, 2002; van Hemert et al., 2001).

14-3-3 представляет собой семейство высококонсервативных, повсеместно экспрессируемых белков. У млекопитающих существует не менее семи изоформ (β, γ, ϵ, σ, ζ, τ и η; фосфорилированные формы β и γ первоначально обозначаются как α и δ соответственно (Aitken et al., 1995), каждая кодируется отдельным геном.В растениях присутствует до 15 изоформ, и две изоформы были идентифицированы у дрожжей: Drosophila melanogaster и Caenorhabditis elegans (Rosenquist et al., 2001; Ван и Шейкс, 1996). Молекулы 14-3-3 образуют гомо- и гетеродимеры (Chaudhri et al., 2003; Jones et al., 1995), которые могут взаимодействовать с широким спектром клеточных белков (рис. 1). 14-3-3 ассоциируется с таким большим количеством различных молекул в значительной степени из-за его специфической фосфосерин / фосфотреонин-связывающей активности (Muslin et al., 1996). Анализ известных сайтов связывания 14-3-3 вместе с использованием пептидных библиотек позволил определить два высокоаффинных фосфорилированных связывающих мотива, которые распознаются всеми изотипами 14-3-3: RSXpSXP (режим 1) и RXXXpSXP. (режим 2), где pS представляет собой фосфосерин (Rittinger et al., 1999; Yaffe et al., 1997). Однако были описаны зависимые от фосфорилирования сайты, которые значительно отличаются от этих мотивов (Aitken, 2002), и следует отметить, что некоторые взаимодействия 14-3-3 не зависят от фосфорилирования. Например, связывание 14-3-3 с экзоферментом S, p190RhoGEF и пептидным ингибитором R18 не требует фосфорилированного остатка (Henriksson et al., 2002; Masters et al., 1999; Petosa et al., 1998; Wang et al., др., 1999; Чжай и др., 2001).

Фиг.1.

Свойства димера 14-3-3. Показанная диаграмма получена из структуры димера 14-3-3ζ, связанного с указанными (стрелками) фосфосериновыми пептидами (регистрационный номер банка данных протеина 1QJB) (Rittinger et al., 1999).

Рис. 1.

Свойства димера 14-3-3. Показанная диаграмма получена из структуры димера 14-3-3ζ, связанного с указанными (стрелками) фосфосериновыми пептидами (номер доступа 1QJB в банке данных белков) (Rittinger et al., 1999).

Независимо от того, зависят ли взаимодействия от фосфорилирования или нет, все мишени, по-видимому, взаимодействуют с одним и тем же связывающим доменом на 14-3-3 (Wang et al., 1999). Кристаллическая структура димеров 14-3-3 в комплексе с короткими пептидами или нативными партнерами по связыванию показала, что каждый мономер содержит амфипатическую бороздку, которая действует как канал связывания лиганда (Liu et al., 1995; Obsil et al., 2001; Риттингер и др., 1999; Xiao et al., 1995; Yaffe et al., 1997). Таким образом, каждый димер содержит два кармана для связывания и, как результат, может взаимодействовать с двумя мотивами одновременно. Они могут быть на одной мишени или на отдельных партнерах связывания (Obsil et al., 2001; Rittinger et al., 1999; Yaffe et al., 1997).

После первоначального описания связывающих мотивов режима 1 и 2 было обнаружено, что различные мишени, такие как BAD, Raf-1 и Cbl, имеют два четко определенных высокоаффинных сайта связывания 14-3-3 (Yaffe et al., 1997). Впоследствии было показано, что другие белки связываются с 14-3-3 через несколько сайтов. В частности, белки, которые ранее были идентифицированы как имеющие один мотив связывания с высокой аффинностью, теперь содержат дополнительные сайты с низким сродством, которые способствуют связыванию 14-3-3 — например, регулятор клеточного цикла Cdc25B (Giles et al. ., 2003). Было предложено, что высокоаффинный сайт действует как «привратник», рекрутируя димер 14-3-3 (Yaffe, 2002). Связывание мономера 14-3-3 с этим сайтом может позволить другим сайтам с низким сродством взаимодействовать со вторым мономером, стабилизируя общий димерный комплекс мишень-14-3-3.Кроме того, учитывая, что фосфопептид, содержащий два мотива, связывает 14-3-3 с 30-кратной большей аффинностью, чем фосфопептид, содержащий один мотив (Yaffe et al., 1997), несколько сайтов с низким сродством могут координированно связывать 14-3-3. -3, как было предложено для связывания 14-3-3 с субъединицей Kir6.2 канала K _ATP (Yuan et al., 2003).

Исторически сложнее всего для исследователей, изучающих 14-3-3, было точное определение роли этого белка в клеточной биологии.Одна из предложенных моделей состоит в том, что 14-3-3 действует как «молекулярная наковальня», которая вызывает конформационные изменения в связывающем партнере, которые могут изменять его ферментативную активность или маскировать или обнаруживать функциональные мотивы, которые регулируют его локализацию, активность, состояние фосфорилирования и / или стабильность (Yaffe, 2002). Тем не менее, 14-3-3 также выполняет адапторные функции, опосредуя взаимодействия между двумя разными партнерами по связыванию — например, тау-белком и киназой гликогенсинтазы 3β (GSK3β; Agarwal-Mawal et al., 2003) или тирозинкиназой рецептора Рона и α6β4 / Интегрин α3β1 (Santoro et al., 2003а). Из-за димерной природы 14-3-3 и его способности взаимодействовать с таким большим количеством разнообразных клеточных белков, одной модели или функции, вероятно, никогда не будет достаточно, чтобы определить роль этого важного семейства белков.

Связывание 14-3-3 в первую очередь зависит от фосфорилирования; следовательно, взаимодействия 14-3-3 в значительной степени регулируются киназами и фосфатазами, которые модулируют состояние фосфорилирования целевого белка.Определение канонических связывающих мотивов режима 1 и режима 2 значительно облегчило идентификацию многих регуляторов киназ. Присутствие остатков аргинина в положениях –3 и –4 в консенсусных последовательностях делает эти мотивы хорошими мишенями для семейства базофильных киназ AGC и семейства кальций / кальмодулин-зависимых киназ (CaMK) (Pearson and Kemp, 1991). Действительно, члены этих семейств киназ, включая протеинкиназу A (PKA), протеинкиназу C (PKC), CaMKI, Chk1, Cds1 / Chk2, Akt и p90Rsk, — все сайты фосфорилирования, которые опосредуют связывание 14-3-3 (для цитирования: первичную литературу, см. ссылки в Aitken, 2002; van Hemert et al., 2001). Однако после идентификации сайтов, которые не соответствуют ни одному из консенсусов, члены других семейств киназ также были вовлечены, включая Cdk5 (Toyo-oka et al., 2003) и LIM киназу (Gohla and Bokoch, 2002).

Фосфорилирование некоторых 14-3-3-связывающих мотивов, по-видимому, является конститутивным, тогда как другие сильно регулируются, фосфорилирование опосредуется киназами, которые активируются в определенных условиях.Кроме того, некоторые сайты являются субстратами нескольких киназ, причем задействованный фермент зависит от типа клетки и условий. Например, как Cdc25C-ассоциированная киназа 1 (C-TAK1), так и киназы контрольной точки Chk1 и Cds1 / Chk2 могут фосфорилировать Cdc25C на S216, который представляет собой сайт стыковки 14-3-3, который регулирует локализацию и функцию Cdc25C. Однако C-TAK1 представляет собой цитоплазматическую киназу, которая фосфорилирует этот сайт в интерфазе (Peng et al., 1998), тогда как киназы контрольной точки представляют собой ядерные ферменты, которые фосфорилируют его после повреждения ДНК (Peng et al., 1997; Sanchez et al., 1997).

Возникающая в связи с изучением регуляторов киназ тема заключается в том, что влияние 14-3-3 на конкретный процесс в некоторых случаях может быть отнесено в первую очередь к активности конкретной киназы или группы киназ. Например, Akt представляет собой киназу, которая играет важную роль в выживании клеток, и, следовательно, многие из антиапоптотических эффектов 14-3-3 включают связывание с субстратами Akt, такими как BAD (Datta et al., 2000; del Peso et al., 1997), фактор транскрипции вилки FKHRL1 (Brunet et al., 1999) и Yes-связанный белок (YAP) (Basu et al., 2003). Сходным образом, фосфорилируя членов семейства фосфатаз Cdc25, киназы контрольных точек Chk1 и Cds1 / Chk2 вносят значительный вклад в ингибирующий эффект, который 14-3-3 оказывает на развитие клеточного цикла после повреждения ДНК (Chen, MS et al., 2003; Peng et al., 1997; Sanchez et al., 1997).

Взаимодействия 14-3-3 могут также регулироваться фосфорилированием других остатков в пределах согласованных связывающих мотивов.Этот механизм регуляции лучше всего охарактеризован в случае опухолевого супрессора p53 и Cdc25C, в котором фосфорилирование остатков в положении –2 относительно 14-3-3-связывающего остатка фосфосерина предотвращает ассоциацию 14-3-3 (Bulavin et al. al., 2003; Waterman et al., 1998). Поскольку многие партнеры связывания 14-3-3 содержат остатки серина / треонина в положении -2 (Yaffe et al., 1997), фосфорилирование этого остатка может представлять собой недооцененный регуляторный механизм.

Не менее важны фосфатазы, дефосфорилирующие стыковочные сайты 14-3-3.Неудивительно, что повсеместно экспрессируемые серин / треониновые протеинфосфатазы PP2A и PP1, обнаруженные во всех эукариотических организмах, играют важную роль в этом процессе (Рис. 2). PP2A представляет собой гетеротримерную фосфатазу, состоящую из димерного ядра (структурная A и каталитическая субъединица C) и регуляторной субъединицы (субъединицы B-типа) (Janssens and Goris, 2001), тогда как PP1 представляет собой димерный фермент, состоящий из каталитической и регуляторной субъединицы ( Коэн, 2002). В настоящее время исследования показывают, что PP2A способствует регуляции связывания 14-3-3 с проапоптотическим агентом BAD (Chiang et al., 2003) и двум компонентам пути передачи сигналов Ras: киназе Raf-1 и каркасу KSR1 (Ory et al., 2003). Каждый из Raf-1 и KSR1 содержит два высокоаффинных фосфосериновых сайта, которые обеспечивают связывание с димером 14-3-3 (Cacace et al., 1999; Muslin et al., 1996). Оба сайта сильно фосфорилированы в покоящихся клетках; однако статус фосфорилирования одного сайта снижается после активации Ras. Хотя предыдущие исследования показали участие PP2A в дефосфорилировании Raf-1 (Abraham et al., 2000; Jaumot and Hancock, 2001), точный механизм запуска дефосфорилирования Raf-1 и роль PP2A в регуляции KSR1 были неизвестны. Недавно Ory et al. с помощью масс-спектрометрии показали, что субъединицы PP2A связаны как с белковыми комплексами KSR1, так и с Raf-1 (Ory et al., 2003). Дальнейшая характеристика этих взаимодействий показала, что, хотя связывание димерного корового комплекса PP2A с Raf-1 и KSR1 является конститутивным, взаимодействие с регуляторной субъединицей B резко возрастает после активации пути Ras.Основной механизм (ы) неясен; однако включение субъединицы B в комплекс должно увеличивать каталитическую активность PP2A. В самом деле, используя ингибиторы фосфатазы, Ory и др. Обнаружили, что активность PP2A необходима для дефосфорилирования сайтов связывания Raf-1 и KSR1 14-3-3 после активации Ras (Ory et al., 2003).

Рис. 2.

Регулирование связывания мишени 14-3-3 протеинфосфатазами.PP2A напрямую взаимодействует с BAD, Raf-1 и KSR1 и опосредует дефосфорилирование pS112 на BAD, pS259 на Raf-1 и pS392 на KSR1. PP1 связывает Cdc25C и тирозинкиназу рецептора Ron и дефосфорилирует сайт pS216 на Cdc25C [обнажая последовательность ядерной локализации (NLS)] и сайт pS1394 на Ron.

Рис. 2.

Регуляция связывания мишени 14-3-3 протеинфосфатазами. PP2A напрямую взаимодействует с BAD, Raf-1 и KSR1 и опосредует дефосфорилирование pS112 на BAD, pS259 на Raf-1 и pS392 на KSR1.PP1 связывает Cdc25C и тирозинкиназу рецептора Ron и дефосфорилирует сайт pS216 на Cdc25C [обнажая последовательность ядерной локализации (NLS)] и сайт pS1394 на Ron.

BAD также связывает 14-3-3 через несколько сайтов. В условиях выживания БАД фосфорилируется по S112, S136 и S155 (Datta et al., 2000; Lizcano et al., 2000; Tan et al., 2000; Zha et al., 1996). S136 действует как привратник для набора 14-3-3, тогда как S112 помогает стабилизировать комплекс (Chiang et al., 2003; Датта и др., 2000). Связывание 14-3-3 удерживает BAD в цитоплазме и, по-видимому, способствует фосфорилированию сайта S155 (Datta et al., 2000; Pastorino et al., 1999; Zha et al., 1996). Фосфорилирование S155 может способствовать образованию комплекса 14-3-3, но его основной эффект заключается в предотвращении связывания BAD с антиапоптическими белками Bcl-2 и Bcl-X _L (Datta et al., 2000; Lizcano et al. ., 2000; Tan et al., 2000). Chiang et al. обнаружили, что после апоптотических стимулов PP2A ассоциируется с BAD и является первичной фосфатазой, дефосфорилирующей сайт S112 (Chiang et al., 2003). Кроме того, эти исследования показали, что дефосфорилирование S112 увеличивает доступность сайтов S136 и S155 для других фосфатаз, что в конечном итоге приводит к высвобождению 14-3-3 и связыванию BAD с Bcl-X _L .

Фосфатаза PP1 также является важным регулятором взаимодействий 14-3-3. Связывание 14-3-3 секвестров Cdc25C в цитоплазме и, чтобы Cdc25C функционировал во время митоза, связывание 14-3-3 должно быть нарушено, обнажая мотив ядерной локализации, который позволяет Cdc25C перемещаться в ядро ​​и активировать митотическую киназу Cdc2. (Graves et al., 2001; Кумагаи и Данфи, 1999; Ян и др., 1999). Элегантные исследования Margolis et al. показали, что PP1 напрямую взаимодействует с N-концом Xenopus laevis Cdc25C через PP1-связывающий мотив и является ферментом, который дефосфорилирует этот важный сайт стыковки 14-3-3 (Margolis et al., 2003). Интересно, что авт. Также обнаружили, что дефосфорилирование сайта связывания сначала требует удаления 14-3-3, стадии, которая зависит, по крайней мере частично, от фосфорилирования Cdc25C с помощью киназы Cdk2.Эти находки поразительно демонстрируют сложность, которая может существовать в регуляции связывания 14-3-3.

Насколько широкую роль PP1 и PP2A играют в модуляции взаимодействий связывания 14-3-3, неизвестно; однако недавние исследования показали участие PP2A в регуляции взаимодействия 14-3-3ϵ-NUDEL (Toyo-oka et al., 2003) и PP1 в качестве регулятора связывания 14-3-3 с тирозинкиназой рецептора Ron (Santoro et al., 2003b).По мере проведения более подробного анализа взаимодействий связывания 14-3-3 количество мишеней, которые, как известно, регулируются этими фосфатазами, несомненно, будет расти.

Одним из важных способов, с помощью которых 14-3-3 регулирует клеточные процессы, является модуляция локализации белка (Muslin and Xing, 2000) (Fig. 3). В большинстве случаев связывание 14-3-3 изолирует целевой белок в конкретном субклеточном компартменте, а высвобождение 14-3-3 затем позволяет цели переместиться.Это перемещение часто происходит из-за воздействия внутренней субклеточной целевой последовательности, которая была замаскирована димером 14-3-3. Этот механизм регуляции способствует удержанию в ядре белков, таких как обратная транскриптаза теломеразы человека (TERT) (Seimiya et al., 2000), Txl-2 (Tang et al., 1998) и Chk1 (Jiang et al., 2003) , и играет решающую роль в перемещении BAD и BAX из цитоплазмы в митохондрии (Nomura et al., 2003; Zha et al., 1996) и в перемещении белков, включая Cdc25, из цитоплазмы и ядра (Kumagai and Dunphy, 1999; Yang и другие., 1999), гистондеацетилазы (Grozinger, Schreiber, 2000), YAP (Basu et al., 2003) и факторов транскрипции вилки (Brunet et al., 1999; Cahill et al., 2001).

Рис. 3.

14-3-3 — регулятор локализации белка. Указаны белки, субклеточная локализация которых регулируется связыванием 14-3-3. Подробности см. В тексте.

Рис. 3.

14-3-3 — регулятор локализации белка.Указаны белки, субклеточная локализация которых регулируется связыванием 14-3-3. Подробности см. В тексте.

Позже стало очевидно, что этот регуляторный механизм также применим к белкам, которые перемещаются из цитоплазмы к плазматической мембране, особенно к белкам, которые участвуют в передаче сигналов Ras и гетеротримерных G-белков. Гетеротримерные G-белки и члены семейства Ras связаны с мембраной; однако многие из их эффекторов и регуляторов локализованы в цитоплазме, и для того, чтобы проявлять свои эффекты, эти молекулы должны перемещаться на поверхность клетки.Различные компоненты этих путей взаимодействуют с 14-3-3, и более подробный анализ этих взаимодействий показал, что при нарушении связывания 14-3-3 многие из этих молекул обнаруживают повышенные уровни ассоциации с плазматической мембраной. Эта усиленная мембранная локализация наблюдалась для компонентов пути Ras Raf-1 (Dhillon et al., 2002), Rin1 (Wang et al., 2002), KSR1 (Ory et al., 2003) и p90 Rsk (Cavet et al. ., 2003), а также регуляторы G-белка RGS3 (Niu et al., 2002) и RGS7 (Benzing et al., 2000). Интересно, что именно высвобождение 14-3-3 только из одного из двух сайтов связывания 14-3-3 в Raf-1 и KSR1 происходит после активации Ras и участвует в локализации мембраны (Ory et al., 2003 ). Как описано выше, связывание димера 14-3-3, по-видимому, маскирует области целевого белка, которые необходимы для транслокации. В случае Raf-1, Rin1 и двух белков RGS связывание 14-3-3 нарушает способность этих белков связываться с мембраносвязанными GTPases (Benzing et al., 2000; Лайт и др., 2002; Ниу и др., 2002; Wang et al., 2002). В случае KSR1 связывание 14-3-3, вероятно, скрывает богатый цистеином С1 домен, который участвует в связывании с мембраной (Zhou et al., 2002). 14-3-3 также играет роль в Ras-зависимой транслокации Byr2 MAPKKK в Schizosaccharomyces pombe (Ozoe et al., 2002), что указывает на то, что регуляция передачи сигналов Ras / G-белка является широко консервативной функцией 14-3-3.

14-3-3 также участвует в транспортировке определенных мультимерных комплексов из эндоплазматического ретикулума (ER) в плазматическую мембрану, включая калиевые каналы KCNK и K _ATP (O’Kelly et al., 2002; Юань и др., 2003). Во время прямой транспортировки контрольно-пропускной пункт незаконного оборота предотвращает выпуск несобранных или неполных форм этих комплексов из ER. Определенные сложные субъединицы содержат мотивы удержания ER, которые связываются с белками COP1, которые, в свою очередь, обеспечивают рециклинг обратно в ER (Ellgaard and Helenius, 2003; Ma and Jan, 2002). Юань и др. и О’Келли и др. показали, что 14-3-3 взаимодействует с компонентами различных мультимерных мембранных комплексов и что эта ассоциация препятствует связыванию COP1 с удерживающими ER мотивами (Yuan et al., 2003; О’Келли и др., 2002). Интересно, что механизм, регулирующий связывание 14-3-3, по-видимому, различен для разных комплексов. В случае KCNK3, инвариантная цепь, ассоциированная с молекулой главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса II, lip35 и никотиновая ацетихолиновая α4-субъединица, связывание 14-3-3 зависит от фосфорилирования и, как результат, зависит от активности киназа для создания сайта связывания (O’Kelly et al., 2002). Напротив, связывание 14-3-3 с каналом K _ATP Kir6.2 субъединица не зависит от фосфорилирования и встречается только с мультимерными комплексами (Yuan et al., 2003). Юан и его коллеги предполагают, что каждая индивидуальная субъединица Kir6.2 содержит независимый от фосфорилирования сайт связывания с низким сродством и что 14-3-3 может связываться с высокой авидностью только тогда, когда собираются комплексы из нескольких субъединиц. Таким образом, 14-3-3 будет действовать как датчик, распознающий только правильно собранные комплексы. Несмотря на различия в механизме, оба исследования предполагают, что связывание 14-3-3 является критическим для преодоления удержания ER и для прямого транспорта комплекса.Важные вопросы, которые еще предстоит решить, это то, сопровождает ли 14-3-3 комплексы на плазматической мембране и выполняет ли 14-3-3 дополнительную функцию на мембране. Кроме того, необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, является ли это общим механизмом регуляции экспорта ER, учитывая, что многочисленные белки содержат как сигналы удержания ER, так и мотивы связывания 14-3-3.

Роль 14-3-3 в раке человека не является неожиданной, учитывая взаимодействие этих белков с компонентами как сигнальной трансдукции, так и регуляторных путей клеточного цикла (Таблица 1).Наиболее убедительные доказательства того, что 14-3-3 участвует в неоплазии, получены из исследований 14-3-3σ. 14-3-3σ является уникальным среди членов семейства 14-3-3 в том, что он экспрессируется преимущественно в эпителиальных клетках (Leffers et al., 1993) и, по-видимому, выполняет специфические для изоформ функции (Chan et al., 1999). Экспрессия 14-3-3σ скоординированно повышается с помощью p53 и BRCA1 и вносит вклад в контрольную точку клеточного цикла повреждения ДНК, опосредованную этими белками (Апреликова и др., 2001; Чан и др., 1999; Чан и др., 2000; Hermeking et al., 1997). В отличие от других членов семейства 14-3-3, которые ингибируют развитие клеточного цикла за счет взаимодействия с фосфатазами Cdc25, 14-3-3σ, по-видимому, вызывает задержку G2 / M, связываясь с комплексами Cdc2-циклин-B и секвестрируя их в цитоплазма (Chan et al., 1999; Laronga et al., 2000). 14-3-3σ также взаимодействует с p53 как часть петли положительной обратной связи (Waterman et al., 1998). Ян и др. обнаружили, что связывание 14-3-3σ защищает p53 от Mdm2-опосредованного убиквитилирования, тем самым стабилизируя его уровни (Yang et al., 2003). Связывание 14-3-3σ также способствует тетрамеризации p53, что приводит к увеличению транскрипционной активности.

Вовлечение 14-3-3 в заболевания человека

Поразительно, но уровни белка 14-3-3σ значительно снижены или незначительны в различных трансформированных клеточных линиях и первичных опухолях эпителиального происхождения, включая большинство рака груди и желудка и гепатоцеллюлярные карциномы (Iwata et al., 2000; Мелис и Уайт, 1999; Nacht et al., 1999; Ostergaard et al., 1997; Прасад и др., 1992; Vercoutter-Edouart et al., 2001). Эта потеря экспрессии происходит из-за метилирования промотора 14-3-3σ (Ferguson et al., 2000; Iwata et al., 2000; Suzuki et al., 2000; Umbricht et al., 2001). Более того, уровень экспрессии 14-3-3σ в некоторых случаях коррелирует со стадией заболевания. Например, 14-3-3σ обнаруживается в гиперпластической ткани груди, но его уровень снижается в тканях с атипичной гиперплазией и отсутствует в раковой ткани (Umbricht et al., 2001). Кроме того, Dellambra et al. показали, что подавление 14-3-3σ составляет единственную стадию, которая может иммортализовать первичные эпителиальные клетки (Dellambra et al., 2000). Таким образом, 14-3-3σ действует как опухолевый супрессор, и потеря его функции может быть решающим событием в прогрессировании некоторых видов рака у человека.

14-3-3 был обнаружен во время систематической характеристики белков мозга; таким образом, кажется уместным, что молекулы 14-3-3 в настоящее время идентифицируются как важные участники развития нейронов и определенных невропатологий (Таблица 1).Ткань мозга содержит самую высокую концентрацию 14-3-3 белков, 14-3-3, что составляет ~ 1% от общего растворимого белка мозга. Эта высокая экспрессия обеспечивает одно возможное объяснение появления изоформ 14-3-3 в спинномозговой жидкости (CSF) людей и животных с определенными нейродегенеративными заболеваниями, такими как скрейпи, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (BSE) и болезнь Крейтцфельда-Якоба ( CJD) (Baxter et al., 2002; Hsich et al., 1996). Предполагается, что утечка белков как следствие прогрессирующей потери нейронов объясняет присутствие 14-3-3 в спинномозговой жидкости пациентов с CJD (Hsich et al., 1996). Однако не все изотипы 14-3-3, экспрессируемые в нормальных нейронах, были обнаружены в спинномозговой жидкости пациентов с CJD (Wiltfang et al., 1999), что привело исследователей к предположению, что некоторые изоформы могут быть предотвращены от проникновения в CSF или что присутствие 14-3-3 происходит не только из-за утечки белка (Berg et al., 2003). В настоящее время нет прямых доказательств того, что 14-3-3 участвует в этиологии CJD; однако, поскольку для окончательного диагноза этого заболевания исторически требовался патологоанатомический анализ (Kretzschmar et al., 1996), прилагаются значительные усилия для подтверждения наличия различных изоформ 14-3-3 в спинномозговой жидкости в качестве надежного биомаркера CJD (Green, 2002).

В отличие от CJD, накапливаются данные о том, что 14-3-3 может способствовать развитию как болезни Альцгеймера (AD), так и болезни Паркинсона (PD). Белки 14-3-3 были идентифицированы в характерных патологических поражениях, связанных с каждым заболеванием, а именно в нейрофибриллярных клубках (NFT) при БА (Layfield et al., 1996) и тельца Леви для PD (Kawamoto et al., 2002; Ubl et al., 2002). NFT в ткани мозга при БА состоят из парных спиральных филаментов, содержащих гиперфосфорилированный тау-белок (Lee et al., 1991; Morishima-Kawashima et al., 1995). Считается, что гиперфосфорилирование этого связывающего микротрубочки белка ингибирует его нормальную функцию, вызывая нестабильность микротрубочек и, в конечном итоге, нейродегенерацию (Lee et al., 2001). Тау может фосфорилироваться многочисленными киназами, включая GSK3β (Reynolds et al., 2000) и Agarwal-Mawal et al.показали, что 14-3-3 облегчает фосфорирование тау-белка, действуя как адаптер, который направляет GSK3β к тау (Agarwal-Mawal et al., 2003). Связывание 14-3-3 также может изменять конформацию тау-белка, делая его более восприимчивым к фосфорилированию (Hashiguchi et al., 2000), и защищать гиперфосфорилированную форму от дефосфорилирования (Agarwal-Mawal et al., 2003), и то и другое. будет способствовать дальнейшему формированию NFT.

PD и диффузная болезнь с тельцами Леви (DLBD) — неврологические расстройства, характеризующиеся наличием внутриклеточных включений, известных как тельца Леви.Основным компонентом телец Леви является α-синуклеин (Spillantini et al., 1997), белок, экспрессируемый в основном в нейронах, который, как предполагается, обладает шаперонной активностью (Ostrerova et al., 1999) и участвует в транспорте везикул (Lotharius et al., 2002) и регуляции нейротрансмиссии дофамина (Perez et al., 2002). 14-3-3 взаимодействует с α-синуклеином (Ostrerova et al., 1999) и колокализуется с ним в тельцах Леви (Kawamoto et al., 2002; Ubl et al., 2002). При БП также наблюдается избирательная потеря дофаминергических нейронов в черной субстанции, области мозга, где преобладают тельца Леви, содержащие α-синуклеин и 14-3-3.Xu et al. обнаружили, что избыточная экспрессия α-synuclein в культивируемых дофаминергических нейронах приводит к накоплению растворимых комплексов α-synuclein – 14-3-3 (Xu et al., 2002). Эти клетки также проявляют повышенную чувствительность к эндогенному дофамину и апоптозу в результате токсичности дофамина. Авторы предполагают, что сверхэкспрессия α-синуклеина индуцирует апоптоз частично за счет секвестрации 14-3-3 и предотвращения его ингибирования проапоптотической функции белков, таких как BAD, FKHRL1, ASK1 и YAP.Хотя необходимы дальнейшие исследования для выяснения функционального значения взаимодействия α-синуклеин-14-3-3 (например, путем изучения того, оказывает ли связывание 14-3-3 какое-либо влияние на активность α-синуклеина), эти провокационные наблюдения предполагают, что 14- 3-3 — фактор, способствующий патологии БП.

Недавние исследования также выявили участие 14-3-3 в патогенезе нейродегенеративного заболевания, спиноцеребеллярной атаксии типа 1 (SCA1).SCA1 принадлежит к классу «полиглутаминовых» заболеваний, который включает болезнь Хантингтона и вызывается увеличением количества тринуклеотидных повторов CAG, кодирующих глутамин, в кодирующей последовательности атаксина-1. Нормальная физиологическая функция атаксина-1 неясна; однако он локализуется в основном в ядрах нейрональных клеток (Servadio et al., 1995) и, как сообщается, связывает РНК in vitro (Yue et al., 2001). Предыдущие исследования показали, что нейротоксичность, наблюдаемая в SCA1, связана с накоплением мутантного полиглутамин-атаксина-1 (Banfi et al., 1994), а недавние сообщения указывают на то, что связывание 14-3-3 вносит вклад в этот процесс (Chen, H.K. et al., 2003; Emamian et al., 2003). Emamian et al. обнаружили, что атаксин-1 фосфорилируется на S776 и что патогенные белки, мутировавшие в этом сайте, имеют пониженную способность образовывать агрегаты и менее токсичны при экспрессии у трансгенных мышей, что позволяет предположить, что фосфорилирование этого сайта имеет решающее значение в патологии SCA1 (Emamian et al. ., 2003).

Последующая работа Chen et al.продемонстрировал, что S776 является сайтом стыковки 14-3-3 и что связывание 14-3-3 с этим сайтом стабилизирует атаксин-1 и замедляет его деградацию (Chen, H.K. et al., 2003). Примечательно, что хотя белки атаксина-1 дикого типа и мутантные белки взаимодействуют с 14-3-3, мутантные белки имеют повышенное сродство к 14-3-3, что коррелирует с длиной экспансии полиглутамина, что указывает на увеличение -функция активности белка, вызывающего заболевание. Дальнейшие доказательства, подтверждающие роль 14-3-3 в патологии SCA1, получены из исследований с использованием модели SCA1 Drosophila .Здесь сверхэкспрессия как 14-3-3, так и патогенного атаксина-1 вызывает более острый нейродегенеративный фенотип, чем наблюдается у мух, экспрессирующих только патогенный атаксин-1 (Chen, H. K. et al., 2003). Генетические исследования на Drosophila дополнительно показывают, что фосфорилирование атаксина-1 может потребовать сигнального пути фосфоинозитид 3-киназы / Akt и может опосредоваться с помощью Akt (Chen, H. K. et al., 2003). Другие полиглутаминсодержащие белки, такие как атаксин-2, атаксин-7, атрофин-1 и субъединица α1A потенциалзависимых кальциевых каналов, содержат потенциальные мотивы связывания 14-3-3, и потребуются дальнейшие исследования, чтобы определить, действительно ли 14- 3-3 также вносит свой вклад в патогенез, связанный с этими белками.

Исследования, посвященные синдрому Миллера-Дикера (МДС), недавно обнаружили роль 14-3-3ϵ в развитии нейронов. MDS и связанная с ним изолированная последовательность лиссэнцефалии (ILS) представляют собой заболевания, характеризующиеся классической лизэнцефалией (гладким мозгом), дефектом миграции нейронов, который приводит к умственной отсталости и эпилепсии (Dobyns et al., 1993). Пациенты с МДС и ИЛС имеют гемизиготные делеции в хромосоме 17p13 человека.3, что приводит к потере последовательностей, кодирующих LIS1 (Dobyns et al., 1993; Reiner et al., 1995), белок, участвующий в моторной функции динеина (Leventer et al., 2001). Однако при МДС делеция больше и сопровождается более тяжелой лиссэнцефалией с дополнительными клиническими симптомами, такими как черепно-лицевые дефекты (Chong et al., 1997; Dobyns et al., 1991). Исследования, направленные на выявление генотипических различий между ILS и MDS, теперь показали, что ген, кодирующий 14-3-3ϵ, всегда удаляется при MDS, но не в ILS, что позволяет предположить, что делеция 14-3-3 ϵ способствует серьезности заболевания. МДС (Cardoso et al., 2003). В поддержку этой модели мышей, лишенных 14-3-3ϵ, имеют дефекты развития и миграции нейронов, аналогичные тем, которые наблюдаются при нокауте LIS1 , а у мышей, у которых отсутствует одна копия как LIS1 , так и 14-3-3 , больше серьезный миграционный дефект, чем у мышей, у которых отсутствует одна копия только одного гена (Toyo-oka et al., 2003).

Toyo-oka и его коллеги обнаружили, что потеря 14-3-3ϵ может влиять на миграцию нейронов, изменяя функцию комплекса LIS1 и, следовательно, моторную функцию динеина (Toyo-oka et al., 2003). В частности, они обнаружили, что 14-3-3ϵ взаимодействует с NUDEL, известным партнером по связыванию LIS1, и что взаимодействие с 14-3-3ϵ защищает Cdk5-фосфорилированный NUDEL от дефосфорилирования. Поддержание статуса фосфорилирования NUDEL имеет решающее значение для правильной локализации и функции комплекса LIS1-NUDEL. Таким образом, в MDS комплекс LIS1, по-видимому, получает двойной удар. Во-первых, из-за меньшего количества белка LIS1 образуется меньше комплексов LIS1-NUDEL. Затем, из-за снижения уровней 14-3-3ϵ, комплексы, которые действительно образуются, более восприимчивы к атаке фосфатазы, что приводит к их неправильной локализации и снижению функции цитоплазматического динеина.Эти исследования ясно демонстрируют, что NUDEL является важной целью 14-3-3ϵ; однако неясно, существуют ли другие партнеры связывания 14-3-3ϵ, которые вносят вклад в тяжесть МДС. Эти исследования также предоставляют убедительные доказательства того, что 14-3-3ϵ выполняет специфические для изоформ функции, в том смысле, что ни один из других изотипов 14-3-3, присутствующих в головном мозге, по-видимому, не компенсирует миграционные дефекты, наблюдаемые после потери 14-3-3ϵ. .

Хотя мы добились значительного прогресса в обнаружении мишеней 14-3-3 и выяснении молекулярных механизмов, лежащих в основе функции и регуляции 14-3-3, остается множество вопросов.В частности, одна область биологии 14-3-3, которая остается неясной, касается роли мономерных белков 14-3-3. Молекулы 14-3-3 естественным образом образуют димеры, но было показано, что фосфорилирование границы раздела димеров способствует образованию мономеров 14-3-3 (Hamaguchi et al., 2003; Powell et al., 2003; Woodcock et al., 2003). Мономеры 14-3-3 могут связываться с белками-мишенями, но неизвестно, как часто мономеры образуются in vivo и выполняют ли они специфические функции in vivo.

Другой вопрос: зачем клеткам нужно много изоформ белка, которые так похожи.Более того, является ли функциональная избыточность определенных изотипов 14-3-3 решающей для клетки? И все ли члены семейства 14-3-3 обладают специфичными для изоформ функциями или это свойство только определенных изотипов? Изучение белков 14-3-3 при заболеваниях человека оказалось неоценимым для раскрытия специфичных для изоформ функций белков 14-3-3. Двумя такими примерами являются участие 14-3-3σ в эпителиальном раке и 14-3-3ϵ в MDS. По мере того, как наши знания о специфических для изоформ функциях 14-3-3 членов семьи увеличиваются, может появиться возможность рассмотреть терапевтические подходы, которые нацелены на активность одной изоформы в определенных контекстах заболевания, не влияя на активность остальных изоформ.Тем не менее, даже если прямые терапевтические применения не будут реализованы, возможно, что информация, касающаяся экспрессии и / или активности различных изоформ 14-3-3, может оказаться полезной для стадирования и прогностической оценки, а также выбора лечения для некоторые виды рака и неврологические заболевания.

Оглядываясь назад на первоначальное открытие 14-3-3, теперь кажется уместным, что эти белки получили общее название, которое не предполагает какой-либо конкретной функции или активности.Действительно, более трех десятилетий исследований показали, что многие разнообразные, но важные клеточные процессы зависят от белков 14-3-3 или находятся под их влиянием. Недавняя работа выдвинула на первый план участие этих молекул в заболеваниях человека, особенно в раке и неврологических синдромах, и вполне вероятно, что другие связи болезней продолжат возникать. Точно так же биохимические исследования продолжают выяснять механизмы, с помощью которых 14-3-3 влияет на активность своих партнеров по связыванию и как эти взаимодействия регулируются.Будущие исследования, несомненно, дадут дополнительную информацию о функциях 14-3-3 и раскроют больше секретов этого удивительного семейства белков.

пи день | Празднуйте математику 14 марта

День числа Пи отмечается 14 марта (3/14) во всем мире. Пи (греческая буква «π») — это символ, используемый в математике для обозначения константы — отношения длины окружности к ее диаметру, равной примерно 3.14159. День числа Пи — это ежегодная возможность для энтузиастов математики повторить бесконечные цифры числа Пи, поговорить с друзьями о математике и съесть пирог.

Пи рассчитано с точностью до 50 триллионов цифр после десятичной точки. Как иррациональное и трансцендентное число, оно будет продолжаться бесконечно, без повторов и шаблонов. Хотя для типичных вычислений требуется всего несколько цифр, бесконечная природа числа Пи делает его интересным для запоминания и вычисления все большего и большего числа цифр с помощью вычислений.
Узнайте больше о Пи — Что такое Пи?

@mometrix Хотите узнать больше о Дне Пи? Ссылка в биографии! ## piday ## pi ## einstein ## alberteinstein ## larryshaw ## math ## fun ## mometrix ## history ## fyp ## fact ## Mathematics ♬ оригинальный звук — Mometrix Test Preparation

Mometrix — это компания по подготовке к экзаменам, которая создала и курирует крупнейшую в мире коллекцию учебных материалов для помощи людям в сдаче стандартизированных тестов с высокими ставками.

Они гордятся тем, что производят самый лучший контент для экзаменов и сертификатов по всей стране. Но что их волнует еще больше, так это дать людям по всей стране возможность реализовать свои мечты. Фактически, создание «подготовки, которая расширяет возможности» заложено в ДНК их компании.

Mometrix ставит своей целью предоставление учебных материалов в сочетании с прилежными усилиями, чтобы дать испытуемым возможность набрать наивысший балл в пределах своих возможностей. Mometrix готовит людей к достижению их мечты, помогая им преодолевать трудности тестирования, необходимые им, чтобы достичь того, чего они хотят.

14 марта — или 14 марта — известен как День Пи! | Исследуйте | Потрясающие мероприятия и забавные факты

С Днем Пи! Нет, не пирог, день (хотя было бы вкусно). Сегодня пи, день — особый математический день, чтобы отпраздновать уникальное число.Прочтите, чтобы узнать почему.

Что такое пи?

Возьмите расстояние по внешней стороне круга (называемое окружностью ). Разделите его на расстояние от одной стороны до другой через середину круга (диаметр называется диаметром ). У тебя есть пи!

Не имеет значения, насколько велик или мал круг. Если вы разделите длину окружности на диаметр, вы всегда получите одно и то же число. Поскольку число всегда одно и то же, оно называется константой .В пи более миллиона цифр (вау!), Но мы просто сократили его до 3,14, чтобы его было легче запомнить. Круто, правда?

Но есть еще много чего!

Даже это не все число пи!

Хорошо, давайте еще точнее. Если разделить длину окружности на диаметр, получится 3,141592653589… ( … означает и так далее )

Число продолжается и продолжается, и продолжается, и продолжается.Нет шаблона. Нет конца.

Это просто строка чисел, которая занимает бесконечное (или бесконечное) количество разрядов. Это одна из вещей, которая делает Пи таким особенным!

Математики потратили невероятное количество времени на вычисление числа Пи. С конца 2017 года оно было рассчитано до 22 459 157 718 261 цифр — это триллионы цифр! Это много пи!

Что с маленьким стулом?

Вы можете увидеть символ числа пи в математических уравнениях.Выглядит это так: π (вроде как стул).

На самом деле это греческая буква P, которая в греческом алфавите называется «пи».

Математики начали регулярно использовать символ пи примерно до 1730-х годов, хотя математики использовали вычисления со времен Древней Греции!

Так почему же число Пи так важно?

Пи используется всякий раз, когда вы хотите проводить измерения или вычисления с использованием кругов. Вы можете использовать его, если вам нужно знать, насколько велика поверхность чего-либо, имеющего форму круга (это называется площадью ).

Но ученые и математики используют число Пи во многих уравнениях, которые делают самые разные вещи. Они могут рассчитать расстояния планет, вращающихся вокруг Солнца. Они могут использовать его для проектирования зданий в зонах землетрясений. Они даже могут использовать его для создания систем, которые помогают сотовым телефонам работать.

Так почему 14 марта отмечается день Пи?

Вы можете догадаться? Если вы посмотрите на месяц (3) и день (14), вы получите… пи (3,14). По крайней мере, если вы напишете дату по-американски (месяц, потом день)!

Теперь, когда вы знаете все о Пи, почему бы не купить себе красивый пирог в форме круга и отпраздновать это событие!

Международный пакт о гражданских и политических правах

Арабский | Китайский | Французский | Русский | Испанский

Текст в формате PDF

Международный пакт о гражданских и политических правах

Принята и открыта для подписания, ратификации и присоединения резолюцией 2200A (XXI) Генеральной Ассамблеи от 16 декабря 1966 года.

Преамбула

Государства-участники настоящего Пакта,

считая, что в соответствии с принципами, провозглашенными в Уставе Организации Объединенных Наций, признание достоинства, присущего всем членам человеческой семьи, а также равных и неотъемлемых прав является основой свободы, справедливости и мира во всем мире,

Признавая, что эти права проистекают из достоинства, присущего человеческой личности,

Признавая, что в соответствии со Всеобщей декларацией прав человека идеал свободных людей, пользующихся гражданской и политической свободой и свободой от страха и нужды, может только быть достигнутым, если будут созданы условия, при которых каждый может пользоваться своими гражданскими и политическими правами, а также своими экономическими и социальными правами. l и культурные права,

Принимая во внимание обязанность государств по Уставу Организации Объединенных Наций содействовать всеобщему уважению и соблюдению прав и свобод человека,

Осознавая, что человек, имеющий обязанности перед другими людьми и обществом к которой он принадлежит, несет ответственность за продвижение и соблюдение прав, признанных в настоящем Пакте,

Согласитесь со следующими статьями:

ЧАСТЬ I

Артикул 1

1.Все народы имеют право на самоопределение. В силу этого права они свободно определяют свой политический статус и свободно осуществляют свое экономическое, социальное и культурное развитие.

2. Все народы могут в своих целях свободно распоряжаться своими природными богатствами и ресурсами без ущерба для любых обязательств, вытекающих из международного экономического сотрудничества, основанного на принципе взаимной выгоды и международного права. Ни в коем случае нельзя лишать народ собственных средств существования.

3. Участвующие в настоящем Пакте государства, включая те, которые несут ответственность за управление несамоуправляющимися и подопечными территориями, содействуют реализации права на самоопределение и уважают это право в соответствии с положения Устава Организации Объединенных Наций.

ЧАСТЬ II

Статья 2

1. Каждое участвующее в настоящем Пакте государство обязуется уважать и обеспечивать всем лицам, находящимся на его территории и под его юрисдикцией, права, признанные в настоящем Пакте, без каких-либо различий, таких как расы, цвета кожи, пола, языка, религии, политических или иных взглядов, национального или социального происхождения, имущественного положения, рождения или другого статуса.

2. Если это еще не предусмотрено существующими законодательными или другими мерами, каждое участвующее в настоящем Пакте Государство обязуется предпринять необходимые шаги в соответствии со своими конституционными процедурами и положениями настоящего Пакта, чтобы принять такие законы или другие меры, которые могут потребоваться для реализации прав, признанных в настоящем Пакте.

3. Каждое участвующее в настоящем Пакте Государство обязуется:

а) обеспечить, чтобы любое лицо, права и свободы которого, признаваемые в настоящем Пакте, были нарушены, имело эффективное средство правовой защиты, несмотря на то, что нарушение было совершено лицами, действовавшими в официальная дееспособность;

(b) Обеспечить, чтобы право любого лица, требующего такого средства правовой защиты, определялось компетентными судебными, административными или законодательными органами, или любым другим компетентным органом, предусмотренным правовой системой государства, и развивать возможности средств судебной защиты;

(c) Для обеспечения того, чтобы компетентные органы применяли такие средства правовой защиты, когда они предоставляются.

Статья 3

Участвующие в настоящем Пакте государства обязуются обеспечивать равное право мужчин и женщин на пользование всеми гражданскими и политическими правами, изложенными в настоящем Пакте.

Артикул 4

1. Во время чрезвычайного положения, которое угрожает жизни нации и существование которого официально провозглашается, участвующие в настоящем Пакте государства могут принимать меры в отступление от своих обязательств по настоящему Пакту в той степени, в которой это строго требуется остротой ситуации. при условии, что такие меры не противоречат их другим обязательствам по международному праву и не влекут за собой дискриминацию исключительно по признаку расы, цвета кожи, пола, языка, религии или социального происхождения.

2. В соответствии с этим положением не допускается отступление от статей 6, 7, 8 (параграфы I и 2), 11, 15, 16 и 18.

3. Любое участвующее в настоящем Пакте государство, пользующееся правом отступления, незамедлительно информирует другие участвующие в настоящем Пакте государства, через посредство Генерального секретаря Организации Объединенных Наций, о положениях, из которых оно имеет отступления и причин, по которым это было задействовано. Дополнительное сообщение должно быть сделано через того же посредника о дате прекращения такого отступления.

Статья 5

1. Ничто в настоящем Пакте не может быть истолковано как подразумевающее для какого-либо государства, группы или лица какое-либо право заниматься любой деятельностью или совершать какие-либо действия, направленные на уничтожение любого из признанных прав и свобод. здесь или при их ограничении в большей степени, чем это предусмотрено в настоящем Пакте.

2. Не допускается никаких ограничений или отступлений от каких-либо основных прав человека, признанных или существующих в каком-либо государстве — участнике настоящего Пакта в соответствии с законом, конвенциями, постановлениями или обычаями под предлогом того, что в настоящем Пакте такие права не признаются. права или что он признает их в меньшей степени.

ЧАСТЬ III

Статья 6

1. Каждый человек имеет неотъемлемое право на жизнь. Это право охраняется законом. Никто не может быть произвольно лишен жизни.

2. В странах, которые не отменили смертную казнь, смертный приговор может выноситься только за самые тяжкие преступления в соответствии с законом, действующим на момент совершения преступления, и не противоречит положениям настоящего Пакта и Конвенции о предупреждении преступления геноцида и наказании за него.Это наказание может быть исполнено только на основании окончательного решения, вынесенного компетентным судом.

3. Когда лишение жизни представляет собой преступление геноцида, подразумевается, что ничто в этой статье не дает права любому участвующему в настоящем Пакте государству каким-либо образом отступать от любого обязательства, взятого на себя в соответствии с положениями Конвенции о предупреждении и защите прав человека. Наказание за преступление геноцида.

4. Каждый приговоренный к смертной казни имеет право ходатайствовать о помиловании или о смягчении приговора.Амнистия, помилование или смягчение приговора к смертной казни могут быть предоставлены во всех случаях.

5. Смертная казнь не выносится за преступления, совершенные лицами моложе восемнадцати лет, и беременным женщинам не выносится.

6. Ничто в настоящей статье не может использоваться для отсрочки или предотвращения отмены смертной казни каким-либо государством — участником настоящего Пакта.

Статья 7

Никто не должен подвергаться пыткам или жестоким, бесчеловечным или унижающим достоинство видам обращения и наказания.В частности, никто не должен без его свободного согласия подвергаться медицинским или научным экспериментам.

Статья 8

1. Никто не может содержаться в рабстве; рабство и работорговля во всех их формах запрещены.

2. Никто не может содержаться в подневольном состоянии.

3.

а) Никто не должен принуждаться к принудительному или обязательному труду;

(b) Пункт 3 (а) не должен считаться препятствием в странах, где лишение свободы с каторжными работами может быть назначено в качестве наказания за преступление, выполнение каторжных работ во исполнение приговора к такому наказанию компетентным корт;

(c) Для целей данного параграфа термин «принудительный или обязательный труд» не включает:

(i) Любую работу или услугу, не упомянутые в подпункте (b), обычно требуемые от лица, находящегося под задержание по законному постановлению суда или лица во время условного освобождения из-под стражи;

(ii) любая служба военного характера и, в странах, где признается отказ от военной службы по соображениям совести, любая национальная служба, требуемая законом об отказниках по соображениям совести;

(iii) Любая услуга, требуемая в случае чрезвычайной ситуации или бедствия, угрожающего жизни или благополучию общества;

(iv) Любая работа или служба, являющаяся частью обычных гражданских обязанностей.

Статья 9

1. Каждый имеет право на свободу и личную неприкосновенность. Никто не может быть подвергнут произвольному аресту или задержанию. Никто не может быть лишен свободы иначе как на таких основаниях и в соответствии с такой процедурой, которые установлены законом.

2. Каждому арестованному сообщаются во время ареста причины его ареста и незамедлительно сообщается любое предъявляемое ему обвинение.

3.Любой арестованный или задержанный по уголовному обвинению должен быть незамедлительно доставлен к судье или другому должностному лицу, уполномоченному законом осуществлять судебную власть, и имеет право на судебное разбирательство в течение разумного срока или на освобождение. Содержание под стражей лиц, ожидающих суда, не является общим правилом, но освобождение может быть обусловлено гарантиями явки в суд на любой другой стадии судебного разбирательства и, в случае необходимости, для исполнения приговора.

4.Каждый, кто лишен свободы в результате ареста или задержания, имеет право обратиться в суд, чтобы этот суд мог безотлагательно вынести решение о законности его задержания и приказать его освободить, если задержание незаконно.

5. Каждый, кто стал жертвой незаконного ареста или задержания, имеет право на компенсацию, имеющую исковую силу.

Статья 10

1. Со всеми лицами, лишенными свободы, следует обращаться гуманно и с уважением достоинства, присущего человеческой личности.

2.

a) Обвиняемые, за исключением исключительных обстоятельств, должны быть изолированы от осужденных и им предоставляется отдельный режим, соответствующий их статусу неосужденных лиц;

(b) Обвиняемые несовершеннолетние отделяются от взрослых и в кратчайшие сроки доставляются для вынесения приговора.

3. Пенитенциарная система включает лечение заключенных, основной целью которого является их исправление и социальная реабилитация.Несовершеннолетние правонарушители должны быть изолированы от взрослых и получать лечение, соответствующее их возрасту и правовому статусу.

Статья 11

Статья 12

1. Каждый, кто находится на территории государства на законных основаниях, имеет на этой территории право на свободу передвижения и свободу выбора места жительства.

2. Каждый может свободно покидать любую страну, в том числе свою собственную.

3. Вышеупомянутые права не подлежат никаким ограничениям, кроме тех, которые предусмотрены законом, необходимы для защиты национальной безопасности, общественного порядка (ordre public), здоровья или нравственности населения или прав и свобод других лиц. и согласуются с другими правами, признанными в настоящем Пакте.

4. Никто не может быть произвольно лишен права на въезд в свою страну.

Статья 13

Иностранец, законно находящийся на территории государства — участника настоящего Пакта, может быть выслан оттуда только во исполнение решения, принятого в соответствии с законом, и должен, за исключением случаев, когда веские причины национальной безопасности требуют иного, иметь право представить доводы против его высылки и чтобы его дело было рассмотрено и было представлено для этой цели перед компетентным органом или лицом или лицами, специально назначенными компетентным органом.

Статья 14

1. Все лица равны перед судами и трибуналами. Каждый имеет право на справедливое и публичное разбирательство дела в компетентном, независимом и беспристрастном суде, учрежденном на основании закона, при рассмотрении любого уголовного обвинения против него или его прав и обязанностей в рамках судебного процесса. Пресса и общественность могут быть отстранены от всего или части судебного разбирательства по причинам морали, общественного порядка (ordre public) или национальной безопасности в демократическом обществе, или когда этого требуют интересы частной жизни сторон, либо в целях степень, строго необходимая, по мнению суда, в особых обстоятельствах, когда гласность нанесет ущерб интересам правосудия; но любое судебное решение, вынесенное по уголовному делу или судебному процессу, должно быть обнародовано, за исключением случаев, когда интересы несовершеннолетних требуют иного или когда судебное разбирательство касается супружеских споров или опеки над детьми.

2. Каждый обвиняемый в совершении уголовного преступления имеет право считаться невиновным до тех пор, пока его вина не будет доказана в соответствии с законом.

3. При рассмотрении любого уголовного обвинения против него каждый имеет право на следующие минимальные гарантии при полном равенстве: (a) Быстро и подробно проинформировать на понятном ему языке о характере и причине обвинение против него;

(b) иметь достаточное время и возможности для подготовки своей защиты и сноситься с выбранным им самим защитником;

c) предстать перед судом без неоправданной задержки;

(d) быть судимым в его присутствии и защищать себя лично или через юридическую помощь по своему выбору; быть проинформированным, если у него нет юридической помощи, об этом праве; и иметь назначенную ему юридическую помощь в любом случае, когда этого требуют интересы правосудия, и бесплатно с его стороны в любом таком случае, если у него нет достаточных средств для ее оплаты;

e) допросить или допросить свидетелей против него и добиться явки и допроса свидетелей от его имени на тех же условиях, что и свидетели против него;

(f) пользоваться бесплатной помощью переводчика, если он не понимает языка, используемого в суде, или не говорит на нем;

(g) Не быть принужденным к даче показаний против самого себя или к признанию вины.

5. Каждый, кто осужден за преступление, имеет право на то, чтобы его осуждение и приговор были пересмотрены вышестоящей судебной инстанцией в соответствии с законом.

6. Когда лицо окончательным решением было осуждено за совершение уголовного преступления и впоследствии его приговор был отменен или он был помилован на том основании, что новый или недавно обнаруженный факт убедительно свидетельствует о том, что произошел выкидыш. правосудия, лицо, понесшее наказание в результате такого осуждения, должно получить компенсацию в соответствии с законом, если не будет доказано, что неразглашение неизвестного факта во времени полностью или частично связано с ним.

7. Никто не подлежит повторному суду или наказанию за преступление, за которое он уже был окончательно осужден или оправдан в соответствии с законом и уголовно-процессуальным законодательством каждой страны.

Артикул 15

1. Никто не может быть признан виновным в совершении какого-либо уголовного преступления на основании любого действия или бездействия, которое не составляло уголовного преступления по национальному или международному праву в момент его совершения. Также не может быть назначено более суровое наказание, чем то, которое применялось во время совершения уголовного преступления.Если после совершения правонарушения законом предусмотрено наложение более мягкого наказания, правонарушитель получает от этого выгоду.

2. Ничто в настоящей статье не препятствует судебному разбирательству и наказанию любого лица за любое действие или бездействие, которое на момент его совершения являлось уголовным преступлением в соответствии с общими принципами права, признанными сообществом наций.

Статья 16

Каждый имеет право везде признаваться правосубъектным.

Статья 17

1. Никто не должен подвергаться произвольному или незаконному вмешательству в его частную жизнь, семью, жилище или корреспонденцию, а также незаконным посягательствам на его честь и репутацию.

2. Каждый имеет право на защиту закона от такого вмешательства или посягательств.

Статья 18

1. Каждый имеет право на свободу мысли, совести и религии.Это право включает свободу иметь или принимать религию или убеждения по своему выбору, а также свободу, индивидуально или совместно с другими, публично или в частном порядке, исповедовать свою религию или убеждения в богослужении, обрядах, обрядах и обучении.

2. Никто не должен подвергаться принуждению, ограничивающему его свободу иметь или принимать религию или убеждения по своему выбору.

3. Свобода исповедовать свою религию или убеждения может подлежать только таким ограничениям, которые предписаны законом и необходимы для защиты общественной безопасности, порядка, здоровья или нравственности или основных прав и свобод других лиц.

4. Участвующие в настоящем Пакте государства обязуются уважать свободу родителей и, в соответствующих случаях, законных опекунов, обеспечивать религиозное и нравственное воспитание своих детей в соответствии со своими собственными убеждениями.

Статья 19

1. Каждый имеет право беспрепятственно придерживаться своего мнения.

2. Каждый имеет право свободно выражать свое мнение; это право включает свободу искать, получать и распространять информацию и идеи любого рода, независимо от государственных границ, в устной, письменной или печатной форме, в форме искусства или любыми другими средствами по своему выбору.

3. Осуществление прав, предусмотренных пунктом 2 настоящей статьи, влечет за собой особые обязанности и ответственность. Поэтому на него могут накладываться определенные ограничения, но они должны быть только такими, которые предусмотрены законом и необходимы:

(a) Для уважения прав или репутации других лиц;

(b) Для защиты национальной безопасности или общественного порядка (ordre public), или общественного здоровья или нравственности.

Артикул 20

1.Любая пропаганда войны запрещена законом.

2. Пропаганда национальной, расовой или религиозной ненависти, представляющая собой подстрекательство к дискриминации, вражде или насилию, запрещается законом.

Статья 21

Признается право на мирные собрания. На осуществление этого права не могут быть наложены никакие ограничения, кроме тех, которые налагаются в соответствии с законом и которые необходимы в демократическом обществе в интересах национальной безопасности или общественной безопасности, общественного порядка (ordre public), охраны здоровья населения. или мораль, или защита прав и свобод других лиц.

Статья 22

1. Каждый имеет право на свободу ассоциации с другими, включая право создавать профессиональные союзы и вступать в них для защиты своих интересов.

2. На осуществление этого права не могут быть наложены никакие ограничения, кроме тех, которые предусмотрены законом и необходимы в демократическом обществе в интересах национальной безопасности или общественной безопасности, общественного порядка (ordre public), защиты общественного здоровья или нравственности или защиты прав и свобод других лиц.Настоящая статья не препятствует наложению законных ограничений на военнослужащих и сотрудников полиции при осуществлении ими этого права.

3. Ничто в настоящей статье не уполномочивает государства-участники Конвенции Международной организации труда 1948 года о свободе ассоциации и защите права на организацию принимать законодательные меры, которые наносят ущерб, или применять закон таким образом, чтобы ущерб гарантиям, предусмотренным в этой Конвенции.

Статья 23

1. Семья является естественной и основной ячейкой общества и имеет право на защиту со стороны общества и государства.

2. Признается право мужчин и женщин брачного возраста на вступление в брак и создание семьи.

3. Ни один брак не может быть заключен без свободного и полного согласия вступающих в брак.

4. Участвующие в настоящем Пакте государства принимают соответствующие меры для обеспечения равенства прав и обязанностей супругов в отношении брака, во время брака и при его расторжении.В случае роспуска должна быть предусмотрена необходимая защита детей.

Статья 24

1. Каждый ребенок должен иметь, без какой-либо дискриминации по признаку расы, цвета кожи, пола, языка, религии, национального или социального происхождения, имущественного положения или рождения, право на такие меры защиты, которые требуются его статус несовершеннолетнего со стороны его семьи, общества и государства.

2. Каждый ребенок должен быть зарегистрирован сразу после рождения и иметь имя.

3. Каждый ребенок имеет право на получение гражданства.

Статья 25

Каждый гражданин должен иметь право и возможность, без каких-либо различий, упомянутых в статье 2, и без необоснованных ограничений:

(a) Принимать участие в ведении государственных дел прямо или через посредство свободно избранные представители;

(b) голосовать и быть избранным на подлинных периодических выборах, которые проводятся на основе всеобщего и равного избирательного права и проводятся тайным голосованием, гарантирующим свободное волеизъявление избирателей;

(c) Иметь доступ на общих условиях равенства к государственной службе в своей стране.

Статья 26

Все люди равны перед законом и имеют право без всякой дискриминации на равную защиту закона. В этом отношении закон запрещает любую дискриминацию и гарантирует всем лицам равную и эффективную защиту от дискриминации по любому признаку, например по расе, цвету кожи, полу, языку, религии, политическим или другим убеждениям, национальному или социальному происхождению, собственности, рождению или другой статус.

Статья 27

В тех государствах, в которых существуют этнические, религиозные или языковые меньшинства, лицам, принадлежащим к таким меньшинствам, не может быть отказано в праве совместно с другими членами своей группы пользоваться своей культурой, исповедуют и исповедуют свою религию или используют свой язык.

ЧАСТЬ IV

Статья 28

1. Создается Комитет по правам человека (именуемый далее в настоящем Пакте Комитет). Он состоит из восемнадцати членов и выполняет функции, указанные ниже.

2. В состав Комитета входят граждане участвующих в настоящем Пакте государств, которые должны обладать высокими моральными качествами и признанной компетентностью в области прав человека, при этом учитывается полезность участия некоторых лиц, имеющих юридический опыт.

3. Члены Комитета избираются и выступают в личном качестве.

Статья 29

1. Члены Комитета избираются тайным голосованием из списка лиц, обладающих квалификацией, предусмотренной в статье 28, и выдвигаемых для этой цели участвующими в настоящем Пакте государствами.

2. Каждое участвующее в настоящем Пакте государство может назначить не более двух человек.Эти лица должны быть гражданами подавшего заявку государства.

3. Лицо имеет право на повторное выдвижение.

Статья 30

1. Первоначальные выборы проводятся не позднее чем через шесть месяцев после даты вступления в силу настоящего Пакта.

2. По крайней мере за четыре месяца до даты каждых выборов в Комитет, за исключением выборов для заполнения вакансии, объявленной в соответствии со статьей 34, Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций направляет письменное приглашение государствам-участникам. к настоящему Пакту представить свои кандидатуры в члены Комитета в течение трех месяцев.

3. Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций составляет в алфавитном порядке список всех выдвинутых таким образом лиц с указанием государств-участников, которые их выдвинули, и представляет его участвующим в настоящем Пакте государствам. не позднее, чем за месяц до даты каждых выборов.

4. Выборы членов Комитета проводятся на заседании участвующих в настоящем Пакте государств, созываемом Генеральным секретарем Организации Объединенных Наций в Центральных учреждениях Организации Объединенных Наций.На этом заседании, на котором две трети участвующих в настоящем Пакте государств составляют кворум, лицами, избранными в Комитет, являются те кандидаты, которые получили наибольшее количество голосов и абсолютное большинство голосов представителей государств. Присутствующие и голосующие стороны.

Статья 31

1. В состав Комитета не может входить более одного гражданина одного и того же государства.

2. При выборах в Комитет следует учитывать справедливое географическое распределение членского состава и представительство различных форм цивилизации и основных правовых систем.

Статья 32

2. Выборы по истечении срока полномочий проводятся в соответствии с предыдущими статьями этой части настоящего Пакта.

Статья 33

1. Если, по единодушному мнению других членов, член Комитета прекратил выполнять свои функции по любой причине, кроме отсутствия временного характера, Председатель Комитета должен уведомляет Генерального секретаря Организации Объединенных Наций, который затем объявляет место этого члена вакантным.

2. В случае смерти или отставки члена Комитета председатель немедленно уведомляет Генерального секретаря Организации Объединенных Наций, который объявляет место вакантным с даты смерти или даты, когда отставка вступает в силу.

Статья 34

1. Когда вакансия объявляется в соответствии со статьей 33 и если срок полномочий заменяемого члена не истекает в течение шести месяцев с момента объявления вакансии, Генеральный секретарь Организация Объединенных Наций уведомляет каждое из участвующих в настоящем Пакте Государств, которые могут в течение двух месяцев представить кандидатуры в соответствии со статьей 29 для заполнения вакансии.

2.Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций составляет в алфавитном порядке список выдвинутых таким образом лиц и представляет его участвующим в настоящем Пакте государствам. Затем проводятся выборы для заполнения вакансии согласно соответствующим положениям этой части настоящего Пакта.

3. Член Комитета, избранный для заполнения вакансии, объявленной в соответствии со статьей 33, занимает должность в течение оставшегося срока полномочий члена, который освободил место в Комитете в соответствии с положениями этой статьи.

Статья 35

Члены Комитета, с одобрения Генеральной Ассамблеи Организации Объединенных Наций, получают вознаграждение из ресурсов Организации Объединенных Наций на таких условиях, которые Генеральная Ассамблея может решить с учетом важности обязанностей Комитета.

Статья 36

Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций предоставляет необходимый персонал и помещения для эффективного выполнения функций Комитета в соответствии с настоящим Пактом.

Статья 37

1. Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций созывает первое заседание Комитета в Центральных учреждениях Организации Объединенных Наций.

2. После первого заседания Комитет собирается в такое время, которое предусмотрено его правилами процедуры.

3. Комитет обычно собирается в штаб-квартире Организации Объединенных Наций или в Отделении Организации Объединенных Наций в Женеве.

Статья 38

Каждый член Комитета перед вступлением в должность должен сделать торжественное заявление в открытом комитете о том, что он будет выполнять свои функции беспристрастно и добросовестно.

Статья 39

1. Комитет избирает своих должностных лиц сроком на два года. Они могут быть переизбраны.

2. Комитет устанавливает свои собственные правила процедуры, но эти правила должны предусматривать, среди прочего, следующее:

(a) Двенадцать членов составляют кворум;

(b) Решения Комитета принимаются большинством голосов присутствующих членов.

Артикул 40

1.Участвующие в настоящем Пакте государства обязуются представлять отчеты о принятых ими мерах, обеспечивающих осуществление признанных в нем прав, а также о прогрессе, достигнутом в осуществлении этих прав: а) в течение одного года с момента вступления в силу настоящего Пакта. настоящий Пакт для заинтересованных Государств-участников;

(b) После этого по просьбе Комитета.

2. Все отчеты представляются Генеральному секретарю Организации Объединенных Наций, который передает их Комитету для рассмотрения.В отчетах должны указываться факторы и трудности, если таковые имеются, влияющие на выполнение настоящего Пакта.

3. Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций может после консультации с Комитетом направить соответствующим специализированным учреждениям копии тех частей отчетов, которые могут входить в сферу их компетенции.

4. Комитет изучает доклады, представленные участвующими в настоящем Пакте государствами. Он препровождает свои отчеты и такие общие комментарии, которые он сочтет необходимыми, государствам-участникам.Комитет может также передать Экономическому и Социальному Совету эти комментарии вместе с копиями отчетов, полученных от государств — участников настоящего Пакта.

5. Участвующие в настоящем Пакте государства могут представлять Комитету замечания по любым комментариям, которые могут быть сделаны в соответствии с пунктом 4 настоящей статьи.

Статья 41

1. Государство-участник настоящего Пакта может в любое время заявить в соответствии с настоящей статьей, что оно признает компетенцию Комитета получать и рассматривать сообщения о том, что одно государство-участник утверждает, что другое государство-участник не выполняет свои обязательства по настоящему Пакту.Сообщения в соответствии с настоящей статьей могут приниматься и рассматриваться только в том случае, если они представлены государством-участником, сделавшим заявление о признании в отношении себя компетенции Комитета. Комитет не принимает никаких сообщений, если они касаются Государства-участника, которое не сделало такого заявления. Сообщения, полученные в соответствии с настоящей статьей, рассматриваются в соответствии со следующей процедурой:

(a) Если участвующее в настоящем Пакте Государство считает, что другое Государство-участник не выполняет положения настоящего Пакта, оно может: письменном сообщении, довести вопрос до сведения этого государства-участника.В течение трех месяцев после получения сообщения принимающее государство должно предоставить государству, которое направило сообщение, объяснение или любое другое заявление в письменной форме, разъясняющее вопрос, которое должно включать, насколько это возможно и уместно, ссылку на внутренние процедуры и принятые средства правовой защиты. , ожидающие рассмотрения или доступные по делу;

(b) Если вопрос не будет урегулирован к удовлетворению обоих заинтересованных Государств-участников в течение шести месяцев после получения государством-получателем первоначального сообщения, любое Государство имеет право передать вопрос в Комитет путем уведомления. передается Комитету и другому Государству;

(c) Комитет рассматривает переданный ему вопрос только после того, как он убедится, что все доступные внутренние средства правовой защиты были задействованы и исчерпаны по данному вопросу в соответствии с общепризнанными принципами международного права.Это не должно быть правилом, если применение средств правовой защиты неоправданно затягивается;

(d) Комитет проводит закрытые заседания при рассмотрении сообщений в соответствии с настоящей статьей;

(e) В соответствии с положениями подпункта (c) Комитет предоставляет свои добрые услуги заинтересованным Государствам-участникам с целью дружественного решения вопроса на основе уважения прав человека и основных свобод, как и признаны в настоящем Пакте;

(f) По любому переданному ему вопросу Комитет может призвать заинтересованные Государства-участники, упомянутые в подпункте (b), предоставить любую соответствующую информацию;

(g) Заинтересованные государства-участники, упомянутые в подпункте (b), имеют право быть представленными при рассмотрении вопроса в Комитете и делать представления устно и / или письменно;

(h) Комитет должен в течение двенадцати месяцев после даты получения уведомления в соответствии с подпунктом (b) представить отчет:

(i) Если решение в рамках подпункта (e) достигнуто, Комитет ограничивает свой отчет кратким изложением фактов и достигнутого решения;

(ii) Если решение в рамках подпункта (е) не достигается, Комитет ограничивает свой отчет кратким изложением фактов; письменные представления и запись устных представлений, сделанных заинтересованными государствами-участниками, прилагаются к докладу.По каждому вопросу отчет направляется заинтересованным Государствам-участникам.

2. Положения настоящей статьи вступают в силу, когда десять участвующих в настоящем Пакте государств сделают заявления в соответствии с пунктом I этой статьи. Такие заявления сдаются Государствами-участниками на хранение Генеральному секретарю Организации Объединенных Наций, который направляет их копии другим Государствам-участникам. Заявление может быть отозвано в любое время путем уведомления Генерального секретаря.Такой отзыв не наносит ущерба рассмотрению любого вопроса, который является предметом сообщения, уже переданного в соответствии с настоящей статьей; никакие дальнейшие сообщения от какого-либо государства-участника не принимаются после получения Генеральным секретарем уведомления об отзыве заявления, если только заинтересованное государство-участник не сделало нового заявления.

Статья 42

1.

(a) Если вопрос, переданный в Комитет в соответствии со статьей 41, не разрешен к удовлетворению заинтересованных Государств-участников, Комитет может с предварительного согласия Государств: Заинтересованные стороны назначают специальную Примирительную комиссию (далее именуемую Комиссией).Добрые услуги Комиссии предоставляются заинтересованным Государствам-участникам с целью полюбовного решения вопроса на основе уважения настоящего Пакта;

(b) Комиссия состоит из пяти человек, приемлемых для заинтересованных Государств-участников. Если заинтересованные государства-участники не достигают соглашения в течение трех месяцев относительно всего или части состава Комиссии, члены Комиссии, в отношении которых не было достигнуто соглашения, избираются тайным голосованием большинством в две трети голосов от общего числа голосов. Комитет из числа своих членов.

2. Члены Комиссии выступают в личном качестве. Они не должны быть гражданами заинтересованных Государств-участников или Государства, не являющегося участником настоящего Пакта, или Государства-участника, которое не сделало заявления в соответствии со статьей 41.

3. Комиссия избирает своего собственного председателя и принимает свои собственные правила процедуры.

4. Заседания Комиссии обычно проводятся в Центральных учреждениях Организации Объединенных Наций или в Отделении Организации Объединенных Наций в Женеве.Однако они могут проводиться в других удобных местах, которые Комиссия может определить в консультации с Генеральным секретарем Организации Объединенных Наций и заинтересованными государствами-участниками.

5. Секретариат, предоставляемый в соответствии со статьей 36, также обслуживает комиссии, назначенные в соответствии с этой статьей.

6. Информация, полученная и сопоставленная Комитетом, предоставляется Комиссии, и Комиссия может обратиться к заинтересованным Государствам-участникам с просьбой предоставить любую другую соответствующую информацию.

7. Когда Комиссия полностью рассмотрит вопрос, но в любом случае не позднее, чем через двенадцать месяцев после рассмотрения вопроса, она представляет Председателю Комитета отчет для передачи заинтересованным государствам-участникам:

(a) Если Комиссия не может завершить рассмотрение вопроса в течение двенадцати месяцев, она ограничивает свой отчет кратким изложением статуса рассмотрения ею вопроса;

(b) Если будет достигнуто полюбовное решение вопроса на основе уважения прав человека, признанных в настоящем Пакте, Комиссия ограничит свой доклад кратким изложением фактов и достигнутого решения;

(c) Если решение в рамках подпункта (b) не достигнуто, в отчете Комиссии должны быть отражены ее выводы по всем фактическим вопросам, имеющим отношение к разногласиям между заинтересованными Государствами-участниками, и ее взгляды на возможности мировое решение вопроса.Этот отчет также должен содержать письменные представления и запись устных представлений, сделанных заинтересованными государствами-участниками;

(d) Если отчет Комиссии представлен в соответствии с подпунктом (c), заинтересованные государства-участники в течение трех месяцев с момента получения отчета уведомляют председателя Комитета о том, принимают ли они содержание отчета или нет. Комиссия.

8. Положения этой статьи не наносят ущерба ответственности Комитета в соответствии со статьей 41.

9. Заинтересованные государства-участники в равных долях несут все расходы членов Комиссии в соответствии со сметой, представленной Генеральным секретарем Организации Объединенных Наций.

10. Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций имеет право оплачивать расходы членов Комиссии, если это необходимо, до их возмещения заинтересованными Государствами-участниками в соответствии с пунктом 9 настоящей статьи.

Статья 43

Члены Комитета и специальных согласительных комиссий, которые могут быть назначены в соответствии со статьей 42, имеют право на льготы, привилегии и иммунитеты экспертов в командировках от Организации Объединенных Наций, как указано в соответствующих разделах Конвенции о привилегиях и иммунитетах Объединенных Наций.

Статья 44

Положения об осуществлении настоящего Пакта применяются без ущерба для процедур, предписанных в области прав человека учредительными документами или конвенциями Организации Объединенных Наций и специализированных учреждений и не препятствует участвующим в настоящем Пакте государствам прибегать к другим процедурам урегулирования спора в соответствии с действующими между ними общими или специальными международными соглашениями.

Статья 45

Комитет представляет Генеральной Ассамблее Организации Объединенных Наций через Экономический и Социальный Совет годовой отчет о своей деятельности.

ЧАСТЬ V

Статья 46

Ничто в настоящем Пакте не должно толковаться как нарушающее положения Устава Организации Объединенных Наций и конституций специализированных учреждений, которые определяют соответствующие обязанности различных органов Организации Объединенных Наций и специализированные учреждения в отношении вопросов, рассматриваемых в настоящем Пакте.

Статья 47

Ничто в настоящем Пакте не должно толковаться как ущемляющее неотъемлемое право всех народов пользоваться и использовать в полной мере и свободно свои природные богатства и ресурсы.

ЧАСТЬ VI

Статья 48

1. Настоящий Пакт открыт для подписания любым государством — членом Организации Объединенных Наций или членом любого из ее специализированных учреждений, любым государством — участником Статута Международного Суда и любое другое государство, которое было приглашено Генеральной Ассамблеей Организации Объединенных Наций стать участником настоящего Пакта.

2. Настоящий Пакт подлежит ратификации. Ратификационные грамоты сдаются на хранение Генеральному секретарю Организации Объединенных Наций.

3. Настоящий Пакт открыт для присоединения любого государства, указанного в пункте 1 настоящей статьи.

4. Присоединение осуществляется путем сдачи на хранение документа о присоединении Генеральному секретарю Организации Объединенных Наций.

5. Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций информирует все государства, подписавшие настоящий Пакт или присоединившиеся к нему, о сдаче на хранение каждой ратификационной грамоты или документа о присоединении.

Статья 49

1. Настоящий Пакт вступает в силу через три месяца после даты сдачи на хранение Генеральному секретарю Организации Объединенных Наций тридцать пятой ратификационной грамоты или документа о присоединении.

2. Для каждого государства, ратифицировавшего настоящий Пакт или присоединившегося к нему после сдачи на хранение тридцать пятой ратификационной грамоты или документа о присоединении, настоящий Пакт вступает в силу через три месяца после даты сдачи на хранение его собственного документа. ратификационной грамоты или документа о присоединении.

Статья 50

Положения настоящего Пакта распространяются на все части федеративных государств без каких-либо ограничений или исключений.

Статья 51

1. Любое участвующее в настоящем Пакте государство может предложить поправку и подать ее Генеральному секретарю Организации Объединенных Наций. Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций затем направляет любые предложенные поправки участвующим в настоящем Пакте государствам с просьбой уведомить его, выступают ли они за созыв конференции государств-участников с целью рассмотрения этих предложений и голосования по ним.Если по крайней мере одна треть государств-участников выскажется за такую ​​конференцию, Генеральный секретарь созывает конференцию под эгидой Организации Объединенных Наций. Любая поправка, принятая большинством государств-участников, присутствующих и участвующих в голосовании на конференции, представляется Генеральной Ассамблее Организации Объединенных Наций для утверждения.

2. Поправки вступают в силу, когда они будут одобрены Генеральной Ассамблеей Организации Объединенных Наций и приняты большинством в две трети участвующих в настоящем Пакте государств в соответствии с их соответствующими конституционными процедурами.3. Когда поправки вступают в силу, они становятся обязательными для тех государств-участников, которые их приняли, а другие государства-участники по-прежнему связаны положениями настоящего Пакта и любой ранее принятой поправкой.

Статья 52

1. Независимо от уведомлений, сделанных в соответствии с пунктом 5 статьи 48, Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций сообщает всем государствам, указанным в пункте I той же статьи, следующие сведения:

а) подписания, ратификации и присоединения согласно статье 48;

b) дате вступления в силу настоящего Пакта согласно статье 49 и дате вступления в силу любых поправок согласно статье 51.

Статья 53

1. Настоящий Пакт, английский, испанский, китайский, русский и французский тексты которого являются равно аутентичными, будет сдан на хранение в архивы Организации Объединенных Наций.

2. Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций направит заверенные копии настоящего Пакта всем государствам, указанным в статье 48.